不同水流速度对虹鳟生长性能、呼吸代谢及免疫相关酶活性的影响❋
代忠义，高勤峰，2❋❋, 高永刚，董双林，2
(1.海水养殖教育部重点实验室(中国海洋大学)，山东 青岛 266003; 2.青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266237; 3.山东省荣成市渔业技术推广站，山东 威海 264300)
水流速度是重要的水环境因子，直接影响着鱼类的生存、生长和发育等一系列生理过程。适当的流速不仅可以促进鱼类的生长，提高能量利用率，还为养殖鱼类带来了充足的溶解氧和清新的水质，为鱼类生长提供了良好的水质环境。在自然界中，大部分鱼类具有趋流性特征，鱼类会根据自身情况选择适合其生存的水流条件。根据鱼的种类不同，其所擅长的运动方式和运动能力也有差异，一些比较活泼的鱼类，例如虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、大西洋鲑鱼(Salmosa-lar)、黄尾鰤(Seriolalalandi)等，喜欢生活在具有一定流速的水环境中，部分底栖鱼类例如大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)等更喜欢生活在静水或缓慢的水流中，这些差异直接或间接影响着鱼类的物质转化和能量代谢[1]。
虹鳟(Oncorhynchusmykiss)隶属硬骨鱼纲(Osteichthyes)鲑科(Salmonidae)大马哈鱼属(Oncorhynchus)，是一种典型的冷水性硬骨鱼类。因其肉质鲜美、蛋白含量高、肌间刺少而深受国内外广大消费者的喜爱，现已成为世界范围内重要的养殖经济鱼类之一。中国冷水性鲑鳟鱼养殖起步较晚，由于受地理环境的限制，主要在具有冷水资源的地区进行淡水养殖，主要养殖方式有流水或微流水池塘养殖、水库网箱养殖、放牧式养殖和工厂化养殖[2]，养殖规模较小，产量较低。海水养殖是实现鲑鳟鱼规模化生产的重要手段，限制我国鲑鳟鱼海水网箱养殖的主要因素是夏季海水温度过高，不适合鲑鳟鱼生存，但在我国黄海中部洼地夏季存在一个巨大的冷水团，其底层水温不高于10 ℃，溶氧充足，水质优良，为鲑鳟鱼的海水养殖提供了优质的自然条件[3-6]。2018年5月4日，我国首座全潜式大型网箱“深蓝一号”建成下水，用于在黄海冷水团海域开展鲑鳟鱼养殖，并于2019年取得成功，实现了在低纬度温带开放海域养殖冷水鱼的创新和突破，对中国“蓝色粮仓”的建设及深远海国家战略的发展具有重要意义[6]。虹鳟鱼耐盐性广，经过海水驯化后能完全适应海水生活，是海水网箱养殖的优质鱼类之一。相关研究表明，虹鳟对海水的适应性随着规格的增大而增强[7]，在海水网箱养殖中，其入海最小规格受入海前的营养状态、盐度、光照等环境条件影响，国外通常将100 g的虹鳟转移到海水中进行网箱养殖[8]，目前中国主要采用300～400 g的虹鳟作为入海规格，经过2年的海水网箱养殖，可达到平均体质量5 kg的商品鱼规格。水流速度是虹鳟养殖的重要影响因素之一，黄海冷水团的水流速度自冷中心向外逐渐增大，流速最大值约为30 cm/s[9-10]，因此，研究不同流速对虹鳟生长及其生理生化指标的影响具有重要意义。
目前，国内关于不同流速对鱼类的影响仅在细鳞鲑(Brachymystaxlenok)[11]、齐口裂腹鱼(Schizothoraxprenanti)[12]、红鳍银鲫(Barbodesschwanenfeldi)[13]和鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)[14]中有过相关报道，其主要研究对象为幼鱼，而且都只是短时间内的水流刺激，并不能体现长期不同的水流对鱼类生理生化的影响。国外学者主要研究了不同流速对鲑鳟鱼的肌肉结构[15]、心脏功能[16]和能量消耗[17]等方面的影响，但关于不同流速对虹鳟生长、呼吸代谢和免疫的影响的研究鲜有报道。本实验探究了不同流速对虹鳟生长、呼吸代谢和免疫的影响，以期为虹鳟养殖流速的选择提供科学的理论指导。
1.1 实验材料和装置
实验用鱼为体格健壮、活性较好的二倍体虹鳟，购于临沂市沂水县万泽丰养殖场，平均体质量为(370.00±5.00)g，平均体长为(30.0±0.5)cm。淡水暂养3 d后进行盐度驯化，初始盐度为0，盐度每天升高2，直至盐度30，使虹鳟完全适应海水生活，随后开始流速养殖实验。如图1所示，实验采用环形泳道装置，在直径2.3 m、高0.5 m的圆柱形养殖池(2.08 m3)中，通过装置圆桶和螺旋桨使之形成一个宽度为0.55 m、高度为0.5 m的环形泳道，通过调节螺旋桨的转速来调节水流速度，使用流速计LS300-A(北京韩泰)测量水流速度，在螺旋桨推进器前后设置拦网，拦网可自由移动，以便选取流速相对稳定的区域进行实验。
(1.变频器；
2.进水口；
3.水槽；
4.支架；
5.圆筒；
6.螺旋桨；
7.排水口；
8.游泳区域；
9.拦网。1.Speed controller；
2.Water inlet；
3.Water channel；
4.Supports；
5.Cylinder；
6.Propeller；
7.Water outlet；
8.Swimming area；
9.Wire grid.)
1.2 实验设计及样品采集
本实验共设置5个流速处理组，分别为0、0.3、0.6、0.9和1.2 bl/s，即每秒流速为0的静水组和每秒流速分别为0.3、0.6、0.9和1.2倍实验鱼初始体长(body length，bl，30 cm)的流水组，将90尾虹鳟均匀地分于5个流速处理组，每组18条，在一周内逐渐将水流速度调节到所需流速。每天使用流速计测2次流速，使流速保持稳定。在整个实验期间，流速和其他养殖环境条件保持恒定。养殖用水为砂滤处理的自然海水，盐度为30，溶解氧为7～8 mg/L，自然光照，每天饱食投喂2次(早8：00和晚19：00)。由于实验饲料为沉性饲料，为保证实验鱼正常摄食，所以投喂时暂停水流约40 min(短时间的停止水流不会对实验结果产生显著影响)。摄食后收集残饵粪便，并将流速调到设定流速。每天换水量为全部水量的1/4，40 d养殖实验结束后，停食24 h，进行样品采集。本实验将每尾鱼视为一个独立样本进行取样，每个处理组随机取虹鳟8尾，麻醉后称量体质量，测量体长，随后使用2.5 mL注射器进行尾静脉取血，并在冰盘上进行活体解剖，取出肌肉、肝脏、胃和肠道组织，液氮迅速冷冻后转移至-80 ℃冰箱中，保存备用。将血液样品注入抗凝管中，3 000 r/min转速离心15 min，抽取上清液，并置于-80 ℃条件下保存。
1.3 呼吸代谢率的测定
由于本实验采用的环形泳道装置体积相对较小，虽然水体与空气有接触，但由于是在静水条件下测定水中溶解氧的变化，测定过程中并无水体流动，并且两次记录溶解氧读数的间隔时间较短，所以短时间内空气和静止小水体间的氧气交换可忽略不记，且在测定开始前，对不放鱼的泳道连续3次监测水中溶解氧含量的变化，每次间隔10 min，发现溶解氧含量并无显著变化，因此本实验采用开放法测定标准呼吸代谢和餐后代谢速率。在养鱼的泳道中，连续3次监测水中溶解氧含量的变化，每次间隔10 min，通过水体中溶解氧减少量计算耗氧率，以耗氧率代表呼吸代谢率。公式如下：耗氧率(mg/(kg·h))=(初始溶解氧(mg/L)-终末溶解氧(mg/L))×水容积(L)/(鱼体质量(kg)×耗时(h))。
1.4 免疫指标的测定
碱性磷酸酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性的测定采用全自动生化分析仪Cobas C-311(Hitachi High-Technologies Corporation, Mannheim, Germany)，试剂盒由罗氏诊断公司提供。超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性、丙二醛含量和蛋白含量均采用南京建成试剂盒测定。超氧化物歧化酶用WST-1法测定，在450 nm处比色测定吸光度值计算其活性，过氧化氢酶采用钼酸铵法测定，在405 nm处测定H2O2变化量，从而计算出过氧化氢酶活性，丙二醛含量采用TBA法测定，在532 nm处比色测定吸光度值计算其含量，蛋白含量采用BCA微板法测定。
1.5 数据统计分析
采用SPSS v25.0软件对所测定数据进行单因素方差分析。若方差分析显著，进一步进行邓肯多重比较，分析组间差异显著性，显著水平设定P<0.05。实验数据采用平均值±标准差(Mean±SD)表示，摄食量以每个实验组在养殖期间摄入的总食物量表示。
2.1 不同流速对虹鳟生长的影响
经过40 d不同流速的养殖实验，虹鳟的生长指标如表1所示。随着流速的增加，虹鳟的终末体质量、体质量增加率、特定生长率、肝体指数都呈先升高后降低的趋势，在流速为0.9 bl/s时达到最大值，其终末体质量、体质量增加率和特定生长率均显著高于流速为0、0.3和0.6 bl/s的实验组(P<0.05)，而和1.2 bl/s的实验组差异不显著(P>0.05)。此外，各流速组间的肝体指数、肥满度、心体指数和脾体指数差异不显著(P>0.05)。总摄食量在0.9 bl/s的流速条件下最高，在0 bl/s的流速条件下最低。饲料系数在0.9 bl/s的流速条件下最低。流速为0和0.3 bl/s的实验组中虹鳟的存活率低于流速为0.6、0.9和1.2 bl/s的实验组。
表1 不同流速对虹鳟生长性能的影响
2.2 不同流速对虹鳟呼吸代谢的影响
如图2A所示，所有流水组虹鳟的标准代谢均显著低于静水组(P<0.05)。随着流速的增加，虹鳟的标准代谢呈先降低后升高的趋势。在0.9 bl/s的流速条件下，虹鳟的标准代谢最低，显著低于流速为0和1.2 bl/s的实验组(P<0.05)，而流速为0.3、0.6和1.2 bl/s的实验组间标准代谢差异并不显著(P>0.05)(见图2A)。此外，流水组的餐后代谢率显著低于静水组(P<0.05)，而不同流速组之间差异不显著(P>0.05)(见图2B)。
(不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。Different lowercase letters represent significant differences(P<0.05).)
2.3 不同流速对虹鳟免疫的影响
不同流速条件下，虹鳟的免疫指标变化情况如图3所示。随着流速的增加，虹鳟血浆中超氧化物歧化酶活力呈先升高后降低的趋势，并在流速为0.9 bl/s时达到最高值，显著高于流速为0、0.3、0.6和1.2 bl/s的实验组(P<0.05)(见图3A)。此外，不同水流条件下，碱性磷酸酶活力与超氧化物歧化酶活力具有相似的变化趋势。随着流速的增加，虹鳟血浆中的碱性磷酸酶活力同样呈先升高后降低的趋势，然而碱性磷酸酶活力在流速为0.6 bl/s时达到最高值，并显著高于流速为0、0.3、0.9和1.2 bl/s的实验组(P<0.05，见图3B)，其他各流水组间碱性磷酸酶活力无显著性差异，均高于静水组(P>0.05，见图3B)。如图3C所示，随着流速的增加，虹鳟血浆中的谷草转氨酶活力呈先升高后降低再升高再降低的趋势。在流速为0.9 bl/s时虹鳟血浆中谷草转氨酶活力最高，其次为0.3 bl/s的实验组，且均显著高于流速为0、0.6和1.2 bl/s的实验组(P<0.05)。虹鳟血浆中谷丙转氨酶活力在流速为0.9 bl/s的实验组显著升高，其余各组间无显著性差异(见图3D)。此外，不同流速条件下，虹鳟肝脏中过氧化氢酶活力和丙二醛含量如图3E和3F所示。随着流速的增加，虹鳟肝脏中过氧化氢酶活力呈先升高后降低的趋势，但并不存在显著性差异(P>0.05)。流速为0.6、0.9和1.2 bl/s的实验组丙二醛含量显著低于流速为0和0.3 bl/s的实验组(P<0.05，见图3F)。
(不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。Different lowercase letters represent significant differences(P<0.05).)
3.1 不同流速对虹鳟生长的影响
通过本研究发现，经过40 d不同流速的养殖实验，0.9 bl/s的流速显著提高了虹鳟的体质量增加率和特定生长率，其他各流速组在统计学上无显著差异，但流水组的体质量增加率和特定生长率均高于静水组。水流增加了食物的消耗，且在0.9 bl/s流速下摄食量最大，但饲料系数最低、生长最快。推测可能是运动训练提高了虹鳟的消化能力，使其对能量的利用效率提高，且水流可能减少了虹鳟个体间的压力和斗争情况，使更多的能量用于生长。相似的研究结果也在其他鱼类中被发现，Li等[18]研究表明，有氧训练提高了中华倒刺鲃(Spinibarbussinensis)幼鱼的摄食量，促进了其生长并提高消化酶活力，Castro等[19]分别以0.8和1 bl/s的流速对大西洋鲑进行了6周持续性和间断性有氧训练，结果表明经过有氧训练的鱼比未经过训练的鱼具有更好的生长性能和游泳能力。在对褐鳟(Salmotrutta)的研究中发现，经过14～28 d的水流训练，和静水组相比，在流速为1.5 bl/s的条件下，鱼的生长速度更快，食物转化效率更高[20]，然而过大的流速(4.5 bl/s)严重损害了鱼体健康，致使其死亡率达到70%。Leon[21]研究发现，在有水流的条件下，美洲红点鲑(Salvelinusfontinalis)不仅提高了生长和身体的健壮性，且饲料系数也有所降低。在本实验中，运动训练对心体指数、肝体指数、脾体指数和肥满度均无显著影响(见表1)，但0.9 bl/s组的心体指数、肝体指数均高于其他组，这和Castro的研究结果相类似，大西洋鲑经过10周的运动训练提高了其心脏质量[22]，这可能为其快速生长提供了支撑。
3.2 不同流速对虹鳟呼吸代谢的影响
呼吸代谢是动物最基本的生命活动,其代谢强度与环境因素有密切的关系。鱼类代谢包括标准代谢、特殊动力作用和活动代谢[23]。标准代谢是鱼类在禁食和安静状态下的代谢，特殊动力作用是动物在进食后一段时间内，由食物刺激机体产生额外热量消耗的作用。相关研究表明，持续性有氧训练可以提高鱼类的心脏功能以及呼吸系统能力，主要包括最大耗氧量[24]、组织氧提取[25]、最大心输出量[22]、红细胞压积[26]和相对心脏大小[27]等。在本实验中，经过40 d的养殖实验，流水组的标准代谢显著低于静水组，0.9 bl/s的流速对标准代谢降低最大。由此表明适当的流速可显著降低虹鳟的标准代谢，这与先前对虹鳟的研究结果相类似，流水养殖虹鳟的标准代谢显著低于静水养殖[28]。在摄食0.5 h后，虹鳟的标准代谢均高于摄食前的标准代谢，这可能是因为食物的摄入而产生了特殊动力作用引起的，且摄食后静水组的标准代谢显著高于流水组，流水组间差异不显著。这可能与流速刺激提高了虹鳟呼吸能力和身体的健壮性有关，持续性的水流增强了虹鳟的鱼体素质，使其适应了持续性的运动，当没有水流刺激时，其维持所需的能量相比于未经过训练的鱼更低。相关的研究在大西洋鲑[29]和瓦氏黄颡鱼(Peltebagrusvachelli)[30]中也有报道，在对野生大西洋鲑进行了18 d的运动训练实验中，发现运动训练改变了大西洋鲑心脏呼吸系统的可塑性，提高了其呼吸能力。瓦氏黄颡鱼经过21 d的训练后，其标准代谢和餐后代谢未发生显著变化,这与本实验结果恰好相反，其原因可能是鱼的种类、大小和训练方案的不同。
3.3 不同流速对虹鳟免疫的影响
提高养殖鱼类的生长性能和免疫力是水产养殖的重要目标。相关研究表明，有氧训练可以提高鱼的生长和抗病能力[19]。免疫酶活性是衡量鱼类健壮性和抗病能力的重要指标，一般认为谷草转氨酶、谷丙转氨酶和碱性磷酸酶在机体非特异性免疫反应中发挥着重要作用。在本实验中，随着流速的增加，谷草转氨酶、谷丙转氨酶和碱性磷酸酶活力均呈先增加后降低的趋势，谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活力在0.9 bl/s条件下最高，而碱性磷酸酶的活力在0.6 bl/s条件下最高，显著高于其他4组，说明有氧训练可以提高虹鳟的非特异性免疫能力，机体在有水流的条件下，能调整自身的生理状况以适应环境的变化，且在0.9 bl/s条件下对提高虹鳟的生长性能和免疫力较有利。有研究表明，有氧运动会增加活性氧的产生[31]，在机体内，细胞不断产生自由基和活性氧作为代谢过程的一部分，当活性氧积累过多时，就会对机体产生影响。目前大多数研究使用丙二醛作为由运动引起的氧化应激的测量指标。超氧化物歧化酶可以催化超氧阴离子，使自由基歧化生成氧和过氧化氢从而对机体起到保护作用，过氧化氢酶作为机体重要的抗氧化酶，可以分解歧化反应产生的最终产物，将过氧化氢分解成水和氧气。在本实验中，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活力随流速的增加呈先升高再降低趋势，在流速为0.9 bl/s条件下活性最高，丙二醛含量则呈逐渐降低的趋势。说明有氧训练有助于提高机体的抗氧化能力，机体在长期的运动条件下健壮性和免疫力得到了提高，有利于其生命活动的进行。
本研究表明，经过40 d的养殖实验，在流速为0.9 bl/s(27 cm/s)的条件下，可显著提高虹鳟的生长性能和免疫能力,同时也显著降低了虹鳟的标准代谢。该结果与目前黄海冷水团最大流速30 cm/s的水文条件及虹鳟入海规格300～400 g的生产实际相吻合。本研究结果可为虹鳟海水养殖选择适宜的流速条件和适宜的入海规格提供参考。
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