形觉剥夺近视早期雏鸡视网膜细胞凋亡相关研究

王田甫 徐琼 朱莉 才艺 王凯 李岩 赵明威

作者单位：1北京大学人民医院眼科，北京 100044；
2视网膜脉络膜疾病诊治研究北京市重点实验室，北京 100034

近视是一种常见的眼部疾病[1-2]。高度近视并发症可导致不可逆视力损伤，带来严重的社会和经济负担[3]。目前近视进展机制不明[4]，深入探索近视原因对于防控近视、预防高度近视并发症有重要的意义。

既往多项研究证实人类病理性近视阶段，视网膜细胞凋亡被激活，研究证实病理性近视患者的感光细胞发生凋亡[5]。近年研究发现形觉剥夺12周的雏鸡会出现漆裂纹样眼底改变，伴随明显的视网膜细胞凋亡[6]。但2008年Andrew等[7]通过近视患者（平均屈光度约-3.92 D）的全基因组连锁研究，筛查出3种与近视相关的基因，这些基因调节线粒体诱导的凋亡过程[8-11]。结合以上研究，我们猜想凋亡并不是在病理性近视阶段才发生的，在近视发展早期，凋亡通路可能就已经被激活。

bax是一种促凋亡基因[12]。bcl-2 通过干扰bax等因子达到抑制细胞凋亡的作用，研究者发现bcl-2与视网膜色素上皮细胞凋亡有关[13-14]。caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶[15]。研究者发现视网膜中caspase-3被激活后，视网膜细胞凋亡增加[16-17]。caspase-8是外源性细胞死亡信号通路中的关键蛋白酶，研究发现caspase-8/HIF-1 α信号通路与视网膜损伤有关[18]。本研究希望通过检测形觉剥夺雏鸡模型中视网膜bax、bcl-2、caspase-3等表达水平的变化，来验证凋亡与近视发生发展的相关性，希望进一步明确近视的可能发病机制，为早期近视防控提供依据。

1.1 实验动物及分组

4日龄的白来航鸡购自北京勃林格殷格翰维通生命技术有限公司。本研究经北京大学人民医院医学伦理委员会批准（批准号：2020PHE091）。所有动物有关程序均按照美国视觉与眼科学研究学会关于眼科和视觉研究中对动物的处理原则，并按照北京大学动物护理和使用委员会提供的指南进行。

2021 年8 月将48 只白来航鸡采用随机数字表法分为对照组（CONT，n=24）和形觉剥夺组（Form deprivation myopia，FDM，n=24）。所有雏鸡均在12 h光照/12 h黑暗的照明条件下饲养。在雏鸡8日龄时，将形觉剥夺组雏鸡右眼作为形觉剥夺眼[19]，根据形觉剥夺时间分为形觉剥夺1周组（FD1W）和形觉剥夺3周组（FD3W），每只雏鸡的左眼作为对照不处理。对照组双眼不作任何处理，形觉剥夺1 周时随机挑选对照组12 只雏鸡作为对照1 周组（C1W），其余继续抚养至形觉剥夺3周，作为对照3周组（C3W）。形觉剥夺前后，测量各组雏鸡的体质量、屈光度、眼轴长度（Axial length,AL）直至形觉剥夺结束以验证动物模型建立成功。

1.2 实验方法

1.2.1 生物学测量 在形觉剥夺前，剥夺后1 周，剥夺后3 周分别使用带状光检影镜（YZ24，苏州六六视觉科技有限公司）进行检影，测量雏鸡屈光度。在异氟烷麻醉下，使用高频A型超声（TECLAB，检测软件为系统自带UTSystem）测量AL（角膜前界至视网膜内界膜前界）。每只眼重复测量15 次，取平均值。

1.2.2 视网膜电图检查 形觉剥夺后1周和3周及在对照组中随机挑选6只雏鸡，将其提前暗适应4 h，进行异氟烷麻醉，使用眼电生理诊断系统（RETIPort21，德国罗兰公司）。记录暗适应和明适应的a波和b波的振幅[20-21]。

1.2.3 组织形态学观察 在形觉剥夺完成后处死雏鸡，于冰上剪出眼球，立刻放入FAS眼球固定液（G1109，武汉赛维尔生物科技有限公司）中。常规脱水、浸蜡、包埋、切片完成石蜡切片，脱蜡水化，苏木素染色，伊红染色，脱水透明，封片完成苏木素-伊红染色（HE染色），在光学显微镜下观察其组织形态。

1.2.4 蛋白免疫印迹实验 本研究使用雏鸡视网膜蛋白进行蛋白免疫印迹实验分析。在形觉剥夺后处死雏鸡，于冰上取出视网膜组织。提取蛋白质，测定浓度，配制蛋白质溶液。电泳采用10%NUPAGE预制胶分离等量的蛋白质，并在250 mA电流将其转移到硝化纤维素膜上1 h。在室温下用封闭缓冲液封闭膜1 h。本研究中使用的主要抗体如下：bcl-2（1:1000）、caspase-3（1:1000）、bax（1:1000）、caspase-8（1:1000）、GAPDH（1:1000），均购自中国Proteintech公司。清洗膜并在室温下与兔IgG（H&L）二级抗体IRDye800CW和小鼠IgG（H&L）二级抗体IRDye800CW（1:1000）孵育1 h。使用双色红外激光成像系统（Odyssey CLX，美国LI-COR公司）拍摄图像。

1.2.5 彩色立体眼底照相 雏鸡形觉剥夺后，使用氯胺酮、赛拉嗪注射液将雏鸡腹腔注射麻醉后，使用视网膜成像系统（OPTO-RIS,英国Optoprobe Science LTD公司）进行彩色立体眼底照相，以果胶（关于鸡pecten oculi结构的介绍参考文献[22]）为照相时的参照系，以确保每次照相的范围和角度相同。

1.2.6 透射电镜 雏鸡形觉剥夺1周和3周后，和相同年龄段对照组雏鸡一起，眼球分别剪取眼底后极部组织片，约2 mm×2 mm，经固定、脱水、渗透、包埋、切片、铀铅双染色后在透射电子镜下观察，采集图像分析。

1.3 统计学方法

实验研究。所有数据采用SPSS 26.0统计学软件进行分析，计量数据符合正态分布，以±s表示，采用独立样本t检验进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 屈光度和AL增长量比较

与对照1 周组[（+2.75±0.99）D]相比，形觉剥夺1 周组[（-9.17±2.14）D]雏鸡（n=12）屈光度出现了明显的近视性改变（t=12.40,P<0.001），同时伴有更多的AL 增长量[（0.47±0.10）mmvs.（1.03±0.54）mm；
t=3.53,P=0.002]。

与对照3周组[（1.30±0.84）D]相比，形觉剥夺3 周组[（-13.00±2.44）D]的雏鸡屈光度同样明显高于对照组（t=12.37,P<0.001）和形觉剥夺1周组[（-9.17±2.14）D；
t=2.63,P=0.030]，同时伴有更多的AL增长量[对照3周组：（0.96±0.08）mm；
形觉剥夺3周组：（2.35±0.17）mm；
t=18.21,P<0.001；
形觉剥夺1周组：（1.03±0.54）mm;t=5.28,P<0.001]。

2.2 视网膜电图（ERG）波幅比较

对照1 周组和形觉剥夺1 周组雏鸡在处理1 周后进行ERG检查，统计各组暗适应和明适应的a波和b波振幅，结果显示2 组a波和b波振幅差异均无统计学意义（均P>0.05）。

对照3 周组和形觉剥夺3 周组雏鸡在处理3 周后进行ERG检查，统计各组暗适应和明适应的a波和b波振幅，结果显示2 组a波和b波振幅差异均无统计学意义（均P>0.05）。

2.3 视网膜切片HE染色

将形觉剥夺1周和3周后的对照组和相应形觉剥夺组雏鸡眼球石蜡切片进行HE染色观察视网膜组织结构，可以看到形觉剥夺1 周和3 周的雏鸡视网膜均未出现明显的结构紊乱（见图1）。

图1.对照组和形觉剥夺组雏鸡视网膜石蜡切片HE染色结果A：对照1周组；
B：形觉剥夺1周组；
C：对照3周组；
D：形觉剥夺3周组Figure 1.HE staining results of paraffin sections of retina in the control and form deprivation groupsA: Control 1 week group;B: Form deprivation 1 week group;C: Control 3 weeks group;D: Form deprivation 3 weeks group.

2.4 雏鸡眼底照相检查

形觉剥夺1周和3周后雏鸡接受腹腔注射麻醉下双眼彩色立体眼底照相，可以看到在为期1周和3周的形觉剥夺结束后，形觉剥夺组雏鸡眼底均未见明显的病理性近视改变。

2.5 形觉剥夺后凋亡相关蛋白表达量变化

与对照1 周组相比，形觉剥夺1 周组鸡视网膜bcl-2 表达量下降（t=2.77,P=0.040），而caspase-3（t=3.44,P=0.026）、bax（t=2.99,P=0.040）、caspase-8（t=5.82,P=0.028）的表达量均明显上升（见图2）。与对照3 周组相比，形觉剥夺组3 周组视网膜抑凋亡因子bcl-2表达量下降（t=4.58,P=0.044），促凋亡因子caspase-3（t=3.25,P=0.023）、bax（t=4.77,P=0.018）、caspase-8（t=5.38,P=0.013）的表达量均明显上升（见图3）。

图2.形觉剥夺1周组和对照1周组雏鸡视网膜蛋白表达量对比与对照1周组相比，形觉剥夺1周组雏鸡视网膜中bcl-2的表达水平在1周后下降，caspase-3、bax、caspase-8的表达水平明显增加Figure 2.Comparison of retinal protein expression in chicks of form deprivation 1 week group and control 1 week groupCompared with the control 1 week group,the expression of bcl-2 in the retina of chicks in the form deprivation 1 week group decreased after one week,and the expression of caspase-3,bax,caspase-8 increased significantly.a,P<0.05.C1W was control 1 week group;FD1W was form deprivation 1 week group.

图3.形觉剥夺3周组和对照3周组雏鸡视网膜蛋白表达量对比与对照3周组相比，形觉剥夺3周组雏鸡视网膜中bcl-2的表达水平在3周后下降，caspase-3、bax、caspase-8的表达水平明显增加Figure 3.Comparison of retinal protein expression of chicks in the form deprivation 3 weeks group and the control 3 weeks groupCompared with the control 3 weeks group,the expression of bcl-2 in the refina of chicks in the form deprivation group decreased after 3 weeks,and the expression of caspase-3,bax,caspase-8 increased significantly.a,P<0.05.C3W was control 3 weeks group;FD3W was form deprivation 3 weeks group.

2.6 形觉剥夺后视网膜细胞超微结构的变化

透射电子显微镜发现，形觉剥夺1周后视网膜中未观察到细胞凋亡表现（见图4）。形觉剥夺3 周后视网膜多个层次细胞的细胞核染色质分布不均匀，可见染色质固缩颗粒聚集；
线粒体重度肿胀，基质大量溶解，嵴消失，空泡变；
粗面内质网中度扩张，局部脱颗粒（见图4）。

图4.形觉剥夺1、3周后对照组和形觉剥夺1、3周组雏鸡视网膜细胞超微结构对比形觉剥夺3周后，通过透射电镜观察到雏鸡视网膜细胞凋亡。A、F：对照1周组；
B、G：形觉剥夺1周组。C、H：对照3周组细胞结构正常，染色质分布均匀，细胞质无明显损伤；
D、I：形觉剥夺3周后，视网膜神经节细胞层可见染色质凝集颗粒（NA）；
E、J：形觉剥夺3周后，视网膜内核层细胞内可见染色质固缩和核内颗粒聚集（NA），内质网（RER）适度扩张和脱颗粒，线粒体（MI）严重肿胀，嵴消失和空泡化Figure 4.Comparison of ultrastructure of retinal cells between control group and form deprivation group after 1 week and 3 weeks of form deprivationAfter 3 weeks of form deprivation,retinal cell apoptosis was observed by transmission electron microscopy.A,F: Control 1 week group.B,G: Form deprivation 1 week group.C,H: In the control 3-week group,the cell structure was normal,the chromatin was evenly distributed,and there was no obvious damage to the cytoplasm.D,I: In the form deprivation 3 weeks group,chromatin condensation granules (NA) were observed in retinal ganglion cell layer.E,J: After 3 weeks of form deprivation,chromatin pyknosis and particle aggregation (NA) in the nucleus,moderate expansion and degranulation of the endoplasmic reticulum (RER),severe swelling of mitochondria (MI),disappearance of cristae and vacuolation can be seen in the cells of the retinal inner nuclear layer.C1W,C3W were control 1 week,3 weeks group;FD1W,FD3W were form deprivation 1 week,3 weeks group.

人类高度近视通常伴随着眼底的退行性改变，包括脉络膜视网膜萎缩、后巩膜葡萄肿和脉络膜新生血管，这些眼底改变将导致不同程度的视力下降。此前，在人类高度近视眼和近视动物模型中都观察到视网膜神经元凋亡[5,23-24]。本研究发现，雏鸡形觉剥夺3周的近视模型在出现视网膜形态学病理改变之前，已经出现视网膜细胞线粒体的重度肿胀，bcl-2下调，bax和caspase-3等凋亡信号通路蛋白的上调，它们可能是视网膜细胞发生细胞凋亡的早期表现，可能导致了后期的近视进展及视网膜病理改变过程。

在目前的研究中，雏鸡形觉剥夺1 周和3 周后的眼球切片HE染色结果未见明显的结构紊乱，其彩色立体眼底照片也显示玻璃体腔清亮，屈光介质透明，眼底未见炎症或变性表现。同时ERG显示2组雏鸡视杆和视锥细胞功能均未见明显差异，提示此次研究中，形觉剥夺并未直接导致雏鸡视网膜形态和功能受损。

以往有很多以形觉剥夺动物模型为对象的研究，多对巩膜差异表达的分子进行检测，分析巩膜重塑影响近视进展的可能通路[25-27]，或针对视网膜蛋白表达谱进行检测，例如多巴胺及其初级代谢产物[28-29]。但既往研究很少且很难分析上游视网膜及脉络膜信号级联反应，究竟通过何种机制调控下游巩膜的重塑，从而影响近视的发生与发展。因此研究者试图从病理性近视视网膜病变机制进行探索。Xu等[5]在研究人近视视网膜变性时发现，在摘除的人病理性近视眼球中，视网膜光感受细胞层存在细胞凋亡，可能是近视视功能下降的重要原因。Pruett[30]也发现在病理性近视导致后巩膜葡萄肿时，有大量的光感受细胞发生凋亡。有研究者发现随着形觉剥夺性近视的海蓝鸡AL不断拉长，在第12周时，海蓝鸡视网膜开始出现病理性改变，外核层和内核层可见凋亡细胞核和凋亡小体，且视网膜中caspase-3样蛋白酶活性升高[31]。因此，有观点认为高度近视视网膜病理性改变与凋亡有明显的相关性，且caspase-3等凋亡信号通路或参与其中。细胞凋亡受到内部凋亡刺激因子的作用，可激活细胞内部线粒体凋亡途径[32-33]。bcl-2家族蛋白是控制细胞凋亡的主要调节因子，它可以控制线粒体相关的凋亡因子释放，进而影响细胞凋亡，bax与bcl-2同源，当其表达时可拮抗bcl-2 的保护作用致使细胞凋亡增加。当线粒体的膜电位下降时，bcl-2 表达水平下降，bax表达水平上升，线粒体膜通透性增加，线粒体内的促凋亡因子如细胞色素C会释放到细胞质中。与Apaf-1相互作用形成凋亡复合体，进一步激活caspase-3和caspase-7，启动caspase级联反应，最终导致细胞凋亡。本研究旨在探索近视动物模型中，这一病理性改变过程最早何时开始出现，为早期进行相关干预提供依据。结果我们发现，形觉剥夺1周雏鸡视网膜蛋白即开始出现凋亡相关因子表达改变，而透射电子显微镜在形觉剥夺3周时开始观察到视网膜细胞中出现了染色质固缩聚集和核孔处染色质颗粒，细胞质中线粒体重度肿胀，内质网中度扩张、脱颗粒等细胞损伤的现象，提示视网膜细胞处于细胞凋亡过程。如果在这个阶段从细胞凋亡调控途径入手，予以有效的药物或基因干预，将会为近视进展调控提供新思路。

本研究通过检测形觉剥夺1周和3周雏鸡模型在近视进展早期视网膜中蛋白表达量的变化，首次证明了形觉剥夺性近视的鸡在出现病理性改变之前，视网膜中bcl-2、bax、caspase-3、caspase-8等均已经出现表达水平显著变化，提示细胞凋亡上调，视网膜细胞中出现了染色质聚集，线粒体的形态变化，重度肿胀，结合凋亡相关因子的变化，提示视网膜发生了细胞凋亡，为近视早期进展与凋亡的关系提供了新的证据，提示了新的可能的早期近视调控通路。未来需要进一步实验设计探索揭示凋亡相关因子的表达变化调控形觉剥夺性近视进展的具体机制，探讨近视防控的可能靶点。

利益冲突申明本研究无任何利益冲突

作者贡献声明王田甫：负责实验研究并撰写论文，包括设计实验、实施研究、数据采集、分析数据、起草及修订文章；
根据编辑部的修改意见进行修改。徐琼、王凯、李岩：参与选题、设计和修改论文的结果、结论。朱莉：参与选题、设计、资料的分析和解释。才艺：参与数据采集、分析数据、起草文章。赵明威：指导实验研究设计，对论文知识性内容作批判性审阅

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