用于卵母细胞玻璃化保存的微流控系统
张宇琪 喻梓瑄 周新丽
（上海理工大学生物系统热科学研究所 上海 200093）
卵母细胞的玻璃化保存是辅助生殖的常用技术，可为由于年龄及医疗因素引起的卵巢功能衰退的女性保存生育能力[1-4]，对珍贵濒危物种保种扩繁也具有重要意义[5]。实现玻璃化保存通常需要在细胞内外加载高浓度的低温保护剂[6]，为减少高浓度的低温保护剂对细胞造成的渗透损伤，需要采用分步法加载和去除低温保护剂。目前，临床上采用多步平衡法对卵母细胞进行低温保护剂的加载和去除[7-8],虽在一定程度上减少了渗透损伤[9]，但仍存在细胞外溶液渗透压阶梯状突变，操作过程中极易造成细胞丢失等问题。此外，目前卵母细胞的玻璃化保存全部由人工操作，不仅对操作人员的技术要求较高，而且完成效率低。随着保存需求的逐年增大，人工操作逐渐难以满足保存需求，且人为因素存在一定的不确定性，所以开发卵母细胞自动玻璃化保存一体化装置十分必要。
微流控芯片可对微量流体进行复杂、精确的操作，在单细胞分析、基因测序、蛋白质结晶等方面发挥独特的作用[10]。近年来研究者们研发了微流控生物芯片用于生育力保存，包括配子与胚胎的筛选、体外培养、体外受精以及低温保存等[11]。Y. S. Heo等[12]使用微流控芯片对卵母细胞进行低温保护剂的加载，但该芯片有几个不同的通道高度且需要气动阀控制流体，制造工艺较为繁琐。周新丽等[13-14]设计了一种在保护剂加载/去除过程中能使低温保护剂浓度连续变化的微流控细胞处理芯片，操作时低温保护剂经蛇形通道混合流入细胞操作腔，但细胞进出操作腔需通过使用口吸器人工控制，完成低温保护剂加载后还需要将细胞从芯片中取出，再加载至载体上进行冷冻，增加了操作难度，不利于卵母细胞自动玻璃化保存的实现。以上两种芯片均采用软光刻法制作的PDMS芯片，需要经过光刻开模，倒胶成型、分层键合等步骤，工艺较为复杂，且制作成本较高。
目前，已有研究人员开发研制了几款卵母细胞及胚胎自动玻璃化保存装置。Liu Jun等[15]设计了胚胎自动玻璃化及复温机器人，通过显微镜与相机定位胚胎位置，并通过机器人操作手进行胚胎玻璃化冷冻，但由于细胞在溶液中的位置无法固定，移动操作耗时较长，转移过程还易出现细胞丢失问题。M. Dal Canto等[16]研发了一款自动玻璃化保存装置，包含独立的机器人移液处理单元，可以向冷冻载体Pod中分两步加入并吸走低温保护剂，但该装置无法用于样品复温后的低温保护剂去除操作，自动玻璃化保存流程不够完整。现有的卵母细胞及胚胎自动玻璃化装置多采用自动化机械手臂替代了分步法低温保护剂加载与去除过程中的人工操作，但仍存在渗透压突变以及细胞容易丢失的问题。采用微流控装置对卵母细胞或胚胎进行保护剂加载和去除，并可用于后续自动玻璃化保存的装置还未见报道。
本文设计制作了一个用于卵母细胞玻璃化保存的微流控系统，既实现了低温保护剂的连续加载/去除，又为后续浸入液氮实现自动玻璃化保存做好准备。首先，采用CO2激光雕刻法制作了用于低温保护剂连续加载/去除的微流控芯片，结合石英毛细管搭建微流控混合系统；
然后，利用灰度值法与折光仪法，验证微流控芯片的混合效率和浓度变化规律；
最后，对比手动多步平衡法与微流体法加载/去除保护剂时卵母细胞的体积响应、存活率和后续发育率。本研究为基于微流控技术的卵母细胞与胚胎的自动玻璃化保存装置的研发提供技术支撑。
1.1 材料与试剂
二甲基亚砜，乙二醇，蔗糖（美国Sigma-Aldrich公司）；
TCM199（美国Gibco公司 12340030）；
M2培养液，KSOM培养液（江苏易核科学仪器有限公司）；
超净工作台（中国苏净集团安泰公司 Airtech）；
体视显微镜（日本MOTIC SMZ-168）；
高速工业相机（深圳市英视科技有限公司 OSG130-210UM）；
CO2培养箱（美国Forma Scientific公司 3111/3131）；
CO2激光雕刻机（美国 UNIVERSAL VLS2.30）。
1.2 主要溶液配置
所用溶液的浓度均指体积分数。基础液BS：TCM199+20%FBS；
平衡溶液ES: 7.5%EG+7.5%DMSO+基础液；
玻璃化溶液VS：15%EG+15%DMSO+0.5 mol/L蔗糖+基础液；
复温溶液TS:1 mol/L蔗糖+基础液；
稀释溶液DS:0.5 mol/L蔗糖+基础液；
透明质酸酶溶液：TCM199+0.1%透明质酸酶；
孤雌激活溶液：M2培养液+5 μg/mL细胞松弛素B。
1.3 小鼠卵母细胞采集
每批取10只雌性小鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin, PMSG） 10 IU，48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin, HCG） 10 IU。在注射HCG后14～16 h内脱颈处死小鼠，剖开腹腔，取输卵管部分，将输卵管转移至含有M2培养液的表面皿中，冲洗干净。在体视显微镜操作台上，找到输卵管膨大部并用眼科针撕开，排出卵丘-卵母细胞复合物。再将卵母细胞团移至含透明质酸酶M2培养液中处理3～5 min反复吹打使卵丘细胞与卵母细胞分离获得裸卵，洗涤3～5次后挑选形态正常卵母细胞移入事先制备好的M2培养液液滴中，放入培养箱备用。
图1 微流控芯片三层结构Fig.1 Structure of three layers of microfluidic chip
1.4 微流控混合系统的搭建
3、林地监测。监测结果表明，2012年库区耕地4429997.22亩，2017年4377062.65亩，五年间林地面积减少52934.57亩。区域退耕还林政策的实施导致库区内林地有所增加。林地减少的主要因素是建设占用和水库淹没。
2018年以来更是动作频频，梦妆入驻美国最大美妆零售商ULTA，悦诗风吟成功进军日本，彩妆品牌赫妍与专业美发品牌AMOS PROFESSIONAL也成功登陆新加坡，兰芝正式进驻澳大利亚所有丝芙兰门店，而伊蒂之屋在进驻迪拜后，预计将进驻中东最大美妆市场——沙特阿拉伯。
图2 微流控混合系统连接示意图Fig.2 Connection diagram of microfluidic mixing system
1.5 微流控混合系统的溶液混合
将玻璃化溶液（15%EG+15%DMSO+ 0.5 mol/L蔗糖+BS）和解冻溶液（1 mol/L蔗糖+ BS）用普通红色染料染色，结合试剂反应法中的色彩分析方法定量分析微通道混合效果。微流控芯片置于光学显微镜载物台上，将含染料的玻璃化溶液和基础溶液各载入一支 1 mL的微量进样针中，固定于一台微注射泵上，设置注射流速为15 μL/min。运行载有基础溶液的注射泵，排尽微通道内的空气，启动两台注射泵，待通道内流体稳定后，按图3检测点（A～G）设置，拍摄相应位置处微通道的图像，每个检测点拍摄10张图像，使用3块芯片重复实验。拍摄结束后，更换芯片并换用含染料的去除溶液重复上述实验。
图3 S型通道检测点设置Fig.3 Detection point setting of S-type channel
1.6 低温保护剂加载和去除
杨云等[14]对比了一步法、多步法和PDMS芯片加载低温保护剂对猪MII期卵母细胞体积变化和后续发育的影响，结果表明，PDMS线性加载组的卵母细胞囊胚率（27.4%）显著高于一步法组（8.3%）和多步法组（15.5%）。衣星越等[19]对比了一步法、两步法和PDMS芯片去除低温保护剂对猪MII期卵母细胞体积变化和后续发育的影响，微流控法去除低温保护剂后，卵母细胞的存活率、体外发育情况等均优于分步去除方法。以上研究中所使用的芯片通道尺寸约为100 μm，采用软光刻技术PDMS材料加工，工艺复杂，且卵母细胞位于芯片分析腔中，不能进行后续的玻璃化冷冻。而本研究改用宽度约200 μm的通道，采用CO2激光雕刻法对PMMA材质进行加工，工艺简便且同样能够实现低温保护剂浓度的线性变化。采用本系统的微流体法8 min组，卵母细胞的囊胚率（53.0%）与对照组无明显差异，说明PMMA芯片加载和去除低温保护剂可以有效减小卵母细胞的渗透损伤，且结合使用石英毛细管更有利于卵母细胞后续的玻璃化冷冻和复温操作。
微流控法：将3～5枚卵母细胞固定在石英毛细管内，不锈钢微丝从毛细管末端插入。将VS溶液与BS溶液各载入一支1 mL 的微量进样针中分别固定在两台注射泵上，设置VS注射参数为0～30 μL/min，BS注射参数为30～0 μL/min，加载时间为8 min。在流速参数不变的情况下，设置加载和去除时间分别为6 min、10 min重复上述实验。
1.7 图像采集
在进行卵母细胞的低温保护剂加载与去除的过程中，使用工业相机拍摄细胞在溶液中的体积动态变化过程，因细胞在高渗溶液中体积变化较为迅速，故设置相机拍摄参数为10 s拍摄1张图片，以保证图像信息的完整性。将卵母细胞假设为理想的球体，利用图形处理软件分析所拍摄图像中每一枚卵母细胞的投影面积，根据球体与投影面积换算公式（1）计算得到卵母细胞的体积。
（1）
式中：V为卵母细胞体积,μm3；
S为卵母细胞投影面积,μm2。
微通道内各处混合情况如图4所示，在入口处低温保护剂溶液已有少许扩散现象，而去除溶液无明显扩散现象，但两种溶液均在入口分层明显。检测点A能观察到两种溶液均有明显的分层现象，而检测点B分层现象已不显著，在出口处已完全观察不到分层现象。
1.8 卵母细胞存活率与发育率判断
完成低温保护剂的去除后将所有卵母细胞吹入M2培养液中，放入CO2培养箱中培养1 h后观察细胞存活状态。以透明带完整无明显变形且卵周间隙均匀，质膜完整，胞质无外流现象，胞质无皱缩、变暗或松散不均匀现象为存活标准。观察结束后将细胞移入孤雌激活溶液中，并放入培养箱中激活处理5 min，然后用M2培养液清洗数次移入KSOM培养液液滴中培养。在激活后16～18 h内观察判断激活结果，若出现原核或发生卵裂则判定为激活成功，若质膜破裂皱缩则判定为死亡，若无明显变化则判定为退化。在激活后的48 h观察并计算卵裂率，挑选卵裂胚胎换液培养，第4天观察发育情况并计算囊胚率。
1.9 数据分析
每组实验重复3～5次，每组共处理 30枚卵母细胞。采用Origin 2021软件中One way ANOVA、Tukey方差分析法进行数据分析，以P<0.05作为差异显著评判标准。
蔡飞等[12-14]发现，在缺氧条件下，血府逐瘀汤含药血清可以增加人微血管内皮株（HMEC-1）细胞活性，增加内皮细胞迁移、黏附和血管腔形成能力。在非缺氧条件下，血府逐瘀汤含药血清可以促进血管数量的增加。同时不同浓度含药血清均可影响碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的转录水平和浓度，通过对内皮细胞的多环节干预调节，促进血管新生。研究发现不同浓度含药血清可以下调EphB4和EphrinB2基因表达，其促血管新生机制与EphB4/EphrinB2密切相关。
2.1 微通道混合效率与溶液浓度变化分析
来一场说走就走的旅行，不是任性，而是实属无奈。原本手头上的事情太多，十一长假也准备好好“奋斗”一番，谁想一通电话的相约，孩子欢呼雀跃吵着要走，如一枚石子骤然敲破平镜的湖面。计划乱了，但心之所动，已飘向了旅途的远方。
图4 通道内混合情况Fig.4 Mixing in the channel
多步平衡法与微流体法对卵母细胞进行低温保护剂加载和去除过程中，卵母细胞的体积变化趋势如图7所示。由图7可知，采用多步平衡法处理细胞时，细胞出现多次剧烈缩胀现象。细胞在分别浸入ES、VS、TS时最快收缩速率达0.834%、0.987%、0.855%V0/s，最小归一化体积分别达到0.496 5、0.546 7、0.443 1。而使用微流体法加载和去除低温保护剂时，可明显观察到体积变化更为平缓，整个过程的最大最小归一化体积仅分别为1.118 4和0.903 8，接近初始体积。
在芯片顶层的溶液进出口处用外径0.6 mm的钢针和内径0.5 mm的硅胶管连接，利用 UV光固胶固定和密封，避免溶液泄漏。微流控芯片溶液入口处的两根硅胶管另一端各连接一台微量注射泵。冷冻载体石英毛细管两端均开口，其中一端为长1 cm、直径2.8 mm的漏斗。鲁尔接头一端插入石英毛细管漏斗端，另一端通过硅胶管与微流控芯片相连微流控混合系统连接，如图2所示。
图5 通道混合指数Fig.5 Mixing index of channel
采用折光法对比了低温保护剂溶液和去除溶液在相同总流速、不同注射时间和流速比例下，芯片出口处溶液的浓度变化，如图6所示。在保护剂加载时间为6、8、10 min时，溶液浓度的折光率均呈线性增长趋势，混合溶液的初始折光率为1.335，最终折光率为1.415。随着注射时间的延长，出口溶液折光率增长速率降低，均可在注射过程中实现浓度由基础液至玻璃化溶液的线性转变；
在保护剂去除时间为6、8、10 min时，溶液浓度的折光率均呈线性降低趋势，随着注射时间的延长，混合溶液折光率降低速率减小，均实现了浓度由复温溶液至基础液的线性转变。综上说明，PMMA芯片可以实现在低温保护剂溶液流速线性增大或去除溶液流速线性减小的情况下，混合溶液的浓度也随之线性增大或减小。
图6 通道出口处溶液折光率Fig.6 Refractive index of the solution at the exit of the channel
2.2 微流控法与多步平衡法对比实验研究
通过拍照并计算各检测点的混合指数，定量分析PMMA芯片混合系统的混合效率，计算结果如图5所示。混合过程中，低温保护剂溶液在40 mm处的混合指数达到0.998 5；
而去除溶液则在55 mm处混合指数才达到0.992 6。这是由于去除溶液中蔗糖含量较高，使溶液黏度增大，流动性降低，混合效率降低。计算结果说明低温保护剂溶液和去除溶液均能在通道出口处完全混合，PMMA混合芯片符合溶液混合需求。
图7 不同加载/去除方案卵母细胞体积变化Fig.7 Volume changes of oocytes in different loading/removal schemes
在使用微流体法处理细胞的整个过程中，卵母细胞虽有膨胀缩小现象，但一直保持着良好的球形度，不同于多步平衡法中，细胞出现不规则收缩。原因可能是多步平衡法中存在溶液混合不均匀或不完全的现象，使细胞周围出现溶液浓度梯度，导致胞内水分优先从浓度更高的一侧流出，形成坑状变形，造成细胞的渗透损伤[17]。而微流体法可使细胞外溶液浓度逐渐且均匀地变化，从而降低细胞内外渗透压差，使细胞形态均匀改变。Lai D.等[18]研究了卵母细胞玻璃化溶液的微流体法加载过程，结果表明，该方法使卵母细胞在低温保护剂加载过程中保持较高的球形度，从而显著降低卵母细胞膜损伤，增强其后续发育能力。综上说明，微流控混合系统和毛细管载体的组合可使卵母细胞在保护剂加载和去除过程中做出体积响应，并能有效减小体积变化程度，减缓体积变化速率，最终减小渗透损伤。
表1所示为多步平衡法与微流体法加载和去除保护剂后卵母细胞存活率与发育率的结果，使用微流体法加载和去除保护剂后，卵母细胞的存活率（93.25%）显著高于多步平衡法组（79.75%），与对照组（97.74%）无显著性差异。微流体法组的卵裂率（77.12%）和囊胚率（53.00%）均高于多步平衡法组（58.74%、37.73%）。说明微流体法可有效减小卵母细胞低温保护剂加载与去除过程的渗透损伤，提高低温保护剂去除后的细胞存活率与发育率。
脑卒中在临床中比较常见，有着较高的致残率，如果没有及时处理，会影响到患者的生活质量和水平。经过相关研究，患者在出现脑卒中之后，相关的中枢神经系统还具备一定的自然恢复功能，具备一定的神经功能。在康复治疗中，需要恢复这些功能，同时利用加速脑侧枝循环的构建，促进侧脑组织或者病灶周围组织的补偿和重组[1] 。所以，使用有效治疗方法和合理康复介入实际可以显著恢复患者的神经功能，改善患者的生活自理能力。在临床康复治疗中，脑梗死患者一般在一周之内，少数的在两天之内，脑出血的患者需要在两周之内介入康复治疗[2] 。
表1 多步平衡法与微流体法加载/去除方案对卵母细胞存活与发育的影响Tab.1 Effects of multi-step and microfluidic loading-removal method on oocyte survival and development rate
2.3 微流体法不同低温保护剂加载/去除时间对卵母细胞的影响
图8 微流体法不同注射时间卵母细胞体积变化Fig.8 Changes of oocyte volume at different injection times by microfluidic method
图8所示为卵母细胞在使用微流体法进行低温保护剂加载/去除时不同加载/去除时间的体积变化。由图8可知，随着加载/去除时间的增长，细胞体积变化程度显著减小，且体积变化速率减缓，细胞在加载/去除时间均为6 min时，最大和最小归一化体积分别达到1.221和0.839。10 min 时，细胞的最大和最小归一化体积仅为1.041 3和0.928 5，相比于6 min 组和8 min 组，加载过程体积改变的程度可减小约8.95%、6.48%，去除过程体积改变程度可减小约17.97%、7.71%。说明注射时间延长可减缓胞外溶液浓度变化速率，缩小胞内外浓度差，从而使细胞体积变化趋于平缓，最后达到渗透平衡时体积也更接近初始体积。
色谱条件：Shimadzu-GL ODS-2色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；
流动相为甲醇-水（75∶25）；
体积流量1.0 mL/min；
检测波长228 nm；
进样量20 μL，柱温30 ℃。
表2所示为微流体法不同注射时间加载/去除保护剂后卵母细胞存活率与发育率的结果。由表2可知，微流控法8 min组的存活率（93.25%）显著高于其余两组。经化学激活培养后，微流控6 min组的卵裂率（67.17%）与10 min组（68.38%）之间无显著性差异，但显著低于8 min 组（77.12%）。对比培养4 d后的囊胚率可发现，6 min组的囊胚率（45.17%）与10 min 组（47.43%）无显著性差异但却低于8 min组（53.00%）。这可能是因为6 min组处理时间较短，相对于其余两组胞外溶液浓度变化速率更快，细胞体积变化更为剧烈，所造成的渗透损伤也更大。而10 min组处理时间过长，虽在减小渗透损伤层面有一定优势，但却增大卵母细胞的毒性损伤，不利于其后期的生长与发育。因此，微流体法8 min组在溶液浓度变化速率和处理时间上具有一定优势，可提高卵母细胞的玻璃化保存效果。
采用多步平衡法与微流控法分别对卵母细胞进行低温保护剂的加载和去除。多步平衡法加载：将3～5枚卵母细胞移至基础液中平衡3 min，转至ES溶液中平衡6 min，再将细胞移至VS溶液中平衡1 min；
多步平衡去除：将卵母细胞移至TS 溶液中平衡1 min，然后移至DS溶液中稀释5 min，最后移至BS溶液中洗涤3 min。
钢纤维混凝土的组成它包含了两种部分，即纤维性材料、颗粒性材料混合而成的，在实践过程中，钢纤维混凝土中包含了钢纤维，使得整体材料的就结构具备抗冲击、抗折、抗疲劳等特点，与传统的混泥土相比质量强度由于传统混凝土材料，正是如此，在道路桥梁施工中该材料得到了广泛的应用。
表2 微流体法不同注射时间对卵母细胞存活与发育的影响Tab.2 Effects of different injection time on oocyte survival and development rate in microfluidic method
本文设计制作了一种用于卵母细胞玻璃化保存的微流控系统，并从流体混合和细胞实验层面对系统功能进行验证，得到结论如下：
1）使用石英毛细管作为低温保护剂加载/去除以及细胞冷冻载体，一体两用简化了原有的细胞进入及取出芯片的方式。
微流控通道结构包括顶层、通道层和底层，如图1所示。流体混合通道为深0.5 mm、宽0.2 mm，总长度60 mm的S型通道。微流控芯片通过CO2激光雕刻法制作，选择厚1 mm的聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）板材为顶层，0.5 mm PMMA板材为通道层和底层，且通道层板材双面预先贴好光学级双面胶，将板材放入雕刻机中分别雕刻出三层，再放入超声波清洗机中清洗 20 min，取出烘干30 min，放入真空贴合机中常温键合。
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2）使用CO2激光雕刻法批量制作PMMA芯片，简化了芯片加工工艺，节省加工成本。灰度值法显示两种溶液均可在通道出口处完全混合均匀，低温保护剂溶液所需混合长度为40 mm，去除溶液所需混合长度为55 mm，折光仪法测试保护剂溶液和去除溶液均可在通道内实现溶液浓度线性变化，所设计的 PMMA 混合系统可满足实验需求。
3）微流体法与多步平衡法相比体积变化速率可降至0.211 7%V0/s，并显著提高卵母细胞的存活率与激活处理后的发育率。微流体法的3组中，8 min 组的存活率、卵裂率和囊胚率（93.25%、77.12%、53%）显著高于其余2组，且存活率和囊胚率与对照组无显著性差异。
微流体混合系统的使用优化了卵母细胞玻璃化保存步骤，为卵母细胞及胚胎的自动玻璃化保存及一体化装置的研制提供了新思路。下一步将开发基于微流控技术的卵母细胞及胚胎自动玻璃化保存装置，实现高自动化、标准化的卵母细胞及胚胎玻璃化保存。
本文受上海市促进市级医院临床技能与临床创新能力三年行动计划重大临床研究项目（SHDC2020CR3077B）资助。（The project was supported by Clinical Research Plan of SHDC（No.SHDC2020CR3077B）.）
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