洗手产品除菌效果评价的离体试验方法研究
孙廷丽， 李彩玲， 陈 静， 叶一均， 林小涵， 杨义熙， 谢小保
广东省科学院微生物研究所，广东省微生物分析检测中心，华南应用微生物国家重点实验室/农业农村部农业微生物组学与精准应用重点实验室/农业农村部农业微生物组学重点实验室/广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东 广州 510070
研究显示，每年因使用不洁净水洗手或不能使用洗手产品进行有效洗手而导致100万人次的死亡[1]。使用香皂等洗手产品，可以将腹泻的风险降低23%～48%，呼吸道感染的风险降低21%～23%[2-4]。因此，洗手特别是使用洗手产品进行正确的洗手，是预防疾病传播的有效手段，对于控制传染性疾病的传播具有积极的意义。
当使用皂类等洗手产品时，产品中的表面活性剂会使皮肤脂肪乳化，并通过与微生物表面的亲脂物质结合，形成乳化颗粒使其更容易从皮肤表面脱离，进而被水冲掉[5]。因此，使用洗手产品进行洗手，可以得到比机械搓洗更好的清洁效果[6]。但在目前，大多数对于手卫生依从性的教育和研究主要是在医院和社区公共卫生系统进行的[7-8]，对于洗手产品的微生物作用的质量评价主要考虑其抗抑菌效果，而非综合的清洁去除作用[9-10]。我国的标准体系中日化产品除菌的概念尚属空白，现有的标准评价方法并不能很好地满足企业和行业对于洗手产品质量控制和宣称的需要。因此，建立一个安全可行的评价此类产品对细菌的去除效果的试验方法，就显得十分必要和迫切。
基于上述问题，本文以仿真皮为载体，验证了仿真皮离体试验与在体试验的相关性，研究并建立了一个洗手产品除菌效果的体外评价方法并验证了该方法的可重复性及适用性，为建立标准化的试验方法提供数据支持和理论依据。
1.1 材料
(1) 试验菌株：金黄色葡萄球菌(StaphylococcusAureus)ATCC 6538、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC 25922，均购自广东省微生物菌种保藏中心，本实验室保存。
(2) 实验载体：离体仿真皮(VITRO-SKIN，IMS)。
(3) 洗手产品：市售产品，分别编号为香皂，洗手液A～C。
1.2 主要仪器
生化培养箱(北京东联哈尔仪器制造有限公司)、拍打式均质器(Bag Mixer 400 mL，法国Inter science公司)、电子天平(常熟双杰测试仪器厂)、摇床(上海智诚分析仪器制造有限公司)、移液枪(Eppendorf)，其他小型设备及耗材均购自广东环凯生物生物技术有限公司。
1.3 试剂与培养基
营养琼脂培养基(NA)、营养肉汤培养基(NB)及SCDLP液体培养基均购自广东环凯生物技术有限公司。
1.4 试验方法
1.4.1体外洗手除菌测试流程
参照ASTM E1174—2013[11]、孙廷丽等体外除病毒的试验方法[12]，并结合细菌的生物学培养特点，初步制定以下流程：
(1) 试验用菌悬液的制备
取标准菌株在NA上划线活化，于(36±1)℃，培养18 h～24 h。用接种环从平板上挑取一个单菌落接种到含有50 mL NB的锥形瓶中，培养18 h～24 h，得到最终浓度为108CFU/mL～109CFU/mL的菌悬液。
(2) 试验载体的准备
无菌条件下打开仿真皮包装，将仿真皮剪成6 cm×6 cm大小，糙面向上备用。每次试验使用9片仿真皮，3片用于基线回收取样(即接种后立即洗脱取样)，3片用自来水清洗后作为对照组试样；
3片用作洗手产品洗手试样。用水润湿仿真皮表面，无菌纸巾轻拍干燥。
(3) 试验菌的接种
取0.1 mL菌悬液接种于仿真皮表面，涂布棒擦拭至整个仿真皮表面，使仿真皮在空气中自然干燥大约30 s。重复该过程3次。
(4) 基线菌落回收
接种完成后，取其中的3片仿真皮，进行基线回收。回收时，将仿真皮分别放入均质袋中，加入10 mL SCDLP，均匀揉搓仿真皮1 min，获得洗脱液，并对洗脱液进行梯度稀释计数。
(5) 体外洗手过程
调节水流速至约(4.0±0.3)L/min。洗手试验用的水为市政自来水，其水质要求符合GB 5749的卫生要求。轻轻打湿染菌的仿真皮，然后按下列方式进行清洗：以自来水清洗作为对照试验组,搓洗30 s，后流水冲洗30 s；
对于固体类产品(如香皂)，使用产品擦15 s，整手掌部分搓洗起泡30 s，后流水冲洗30 s；
对于液体类产品(如洗手液)，称取0.45 g 样品至皮表面，整手掌部分搓洗起泡30 s，后流水冲洗30 s；
冲洗完毕，使用无菌纸巾轻轻拍干皮表面。将洗后的仿真皮分别进行菌落回收计数，回收方式同基线回收。
(6) 结果计算
以每次试验时3片洗手产品洗手后取样的离体仿真皮相对3片基线回收的仿真皮上菌落减少的对数平均值。
(7) 除菌有效性的确定
按相同测试条件进行2次测试，每次测试设置3个实验重复，共6个重复。对6片对照组回收对数值与试验组菌回收对数值进行t检验，显著性水平取p≤0.05(双尾检验)，评价测试样品与对照样品除菌性能是否存在差异。当两组样品结果存在显著性差异，且对照组菌落对数值大于试验组时，可认为试验组样品具有除菌功效。
1.4.2仿真皮与在体洗手试验的相关性研究
制备2.0×108CFU/mL～2.0×109CFU/mL的菌悬液备用；
样品选用洗手液A、洗手液B和洗手液C。分别使用在体洗手方法及离体洗手流程进行洗手除菌试验，并对结果进行统计学分析，验证二者之间的相关性。
在体试验采用《消毒技术规范》中消毒剂对手消毒模拟现场实验的方法[13]。即将每个样品分为2组，每组5人。首先使用液体肥皂洗手1 min去除手表面污染的自然菌，然后用无菌纱布将手擦干。将2×108CFU/mL～2×109CFU/mL菌悬液放入一无菌容器中，将手掌中间到指尖部位浸入菌悬液中，手指分开，停留5 s，将手离开菌悬液，在空气中干燥3 min。干燥后立即将拇指与其他手指尖在含 10 mL TSB的平皿中搓洗1 min，取适当稀释度接种平皿。计数菌落数，作为试验前菌落数。不再重复污染手，立即进行试验组处理。按说明书介绍的用量、作用时间和使用频率以标准的洗手方法(搓擦30 s～60 s)。以流动的自来水冲洗5 s，抖掉手上残留的水。立刻将拇指与其它手指尖在含10 mL中和剂的平皿中搓洗1 min，做适当稀释后，分别取样液1.0 mL以倾注法接种两个无菌平皿，放37 ℃恒温箱培养48 h，计数菌落数。离体试验按1.4.1描述的洗手步骤进行试验。试验重复组数和试样个数同在体试验。
1.4.3方法的确认及验证
需要确认的内容为使用洗手液、香皂对两种细菌的去除率以及测试方法对不同产品剂型的适用性。另外，使用人员比对的方式验证方法的可重复性。
1.4.4数据分析[14,15]
根据需要，将回收菌落数转换为对数值。用x±s计算结果的指定值，采用变异系数(Coefficient of variation， CV)来考察数据的稳定性和可重复性；
以|Z|值计算人员比对的有效性，使用SPSS计算方差齐性及t检验的p值。
2.1 仿真皮与在体洗手试验的相关性
3种洗手液分别进行在体洗手和离体洗手的除菌效果情况见表1。试验结果显示，在使用3种洗手液进行在体洗手时，两种细菌减少的对数值均大于3，介于3.39～3.87之间，去除效果都比较理想，但是针对同一种微生物分别进行5组实验人员结果的重复性分析，其变异系数(CV)相对比较大，最大的达到了13.59%，这说明试验的结果受受试者个体差异影响比较大。在使用仿真皮作为试验载体时，3种洗手液作用后，金黄色葡萄球菌的细菌平均减少对数值分别为3.47、3.61及3.82，大肠杆菌的细菌平均减少对数值分别为3.39、3.44及3.58，这些结果与在体模拟实验的结果相近，人造皮与在体试验的结果均没有统计学差异(在体试验及离体仿真皮试验的同一种样品、同一种微生物的洗去效果进行双样本等方差t检验，其P(0.05)均大于0.54)。综上所述，仿真皮试验结果与在体试验结果具有一定的相关性，而且结果稳定性好，是一种理想的试验载体。
表1 在体与离体洗手方法对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的去除效果比较
2.2 不同洗手产品的除菌效果试验
使用市场上购买的不同的洗手产品(洗手液A～洗手液C，香皂)作为试样，以金黄色葡萄球菌ATCC6538及大肠杆菌ATCC25922作为测试菌种，按离体除菌的试验方法进行试验，结果见表2。由表可知，金黄色葡萄球菌为试验菌种时，洗手液A～洗手液C、香皂及清水进行洗手试验时，载体上微生物的对数减少值分别为3.47、3.61、3.82、4.75及2.05，P(0.05)均<0.01，具有统计学意义；
4种产品在5组试验中的变异系数分别是7.41%、7.65%、6.25%及2.68%。使用大肠杆菌ATCC25922作为实验菌种的的结果与金黄色葡萄球菌相似。采用洗手液A～洗手液C、香皂及清水进行洗手试验时，载体上微生物的对数减少值分别为3.39、3.44、3.58、4.89及2.11，变异系数分别为6.28%、7.26%、4.60%及4.40%，与对照组的去除效果相比，其P(0.05)均<0.01。
表2 不同洗手产品的除菌效果试验
为对产品的除菌有效性进行评价，选取了香皂产品进行了两次重复试验，共获得6个平行数据，并对其进行了统计分析。结果见表3，当使用香皂进行洗手除大肠杆菌的试验时，其基线恢复均大于107CFU/片，每片之间的偏差为0.08；
对试验组和对照组回收到的细菌的对数值进行F检验，其P0.05=0.37，P0.05>0.05，两组试验方差齐；
对试验组及对照组的回收对数值进行t检验，其P0.05<0.01，表明两组之间具有统计学意义，说明测试的香皂相较仅使用清水进行洗手时，具有增加细菌去除的效果，计算获得其除菌对数值为4.79。
表3 某香皂对大肠杆菌的去除效果
上述试验结果表明，该方法适用于洗手液及香皂等不同剂型的产品的除菌效果的测试，并可以根据需要进行除菌效果的评价。使用统计学分析确定产品的除菌效果，并以除菌率来表征试验结果，是科学可行的。同时由于其实验重复较少，有效的降低了试验成本及工作量，是一种比较合理的评价方式。
2.3 人员比对试验
4位检验人员作为分别按照离体试验方法对4个样品及水样样进行了一次除大肠杆菌的检测，结果见表4。对试验结果进行计算分析，所有人的|Z|值均小于2。表明所有实验人员的结果一致，没有出现数据偏离，表明方法可重复性好。
表4 人员比对试验结果
本研究以离体仿真皮为试验载体，进行了两种常见剂型的洗手产品的除菌效果的测试，建立了一种安全、简便、可操作性强的实验流程。该方法与在体试验相关性较好，以统计学方式对产品的除菌效果进行评价，减少了试验可能引起的结果不稳定性的情况。同时，该方法能区分不同除菌能力的产品，适用于液体及固体两种剂型，重复性及稳定性好，具有较好的应用价值，为进一步建立标准化的测试方法提供了数据支持，有助于填补我国日化产品除菌效果的性能评价的标准缺失的空白，促进行业的进步和发展。
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