基于响应面法建立焦山楂类黑精超声提取方法及其体外抗氧化研究
艾莉，张礼林，徐佳馨，吴纯洁
(成都中医药大学，四川 成都 611137)
山楂是蔷薇科植物山里红CrataeguspinnatifidaBge.var.MajorN.E.Br.或山楂CrataeguspinnatifidaBge.的干燥成熟果实。焦山楂是山楂经清炒法炮制而来，传统中医认为焦山楂能显著增强山楂消食导滞的功效，现代研究也已证明这一点[1-2]。而从山楂到焦山楂这一炮制过程中的物质变化并不清晰，现有山楂的炮制机制研究并不能很好地解释山楂炒焦增强消食导滞这一药效变化。
山楂在炒焦过程中，其中的糖类与蛋白质会发生美拉德反应[3]，形成一类结构复杂、聚合度不等的高分子聚合物混合体，称为类黑精(Melanoidins)[4]。有相关研究表明类黑精具有多种药理效应，包括抗氧化[5]、降血压[6]、抗菌抗炎[7]和调节肠道菌群[8]等。肠道的氧化还原信号的紊乱是胃肠道功能失调的重要原因之一[9]，外源性的抗氧化剂对调节肠道功能有一定的帮助[10]。肠道菌群是消化功能的重要影响因素[11]，而有研究显示，类黑精影响肠道菌群是其发挥作用的重要方式[12],焦山楂炒焦产生的类黑精的抗氧化和对肠道菌群的调节作用可能是焦山楂消食导滞功效增强的原因之一。
现有对于焦山楂类黑精的相关研究较少，也未见焦山楂类黑精提取方法的相关报道。超声提取法与其它提取方法相比，具有高效、节能、操作方便等优点，故本研究基于响应面法建立了焦山楂类黑精的超声提取方法，为焦山楂类黑精的后续研究奠定了基础。本研究还验证了焦山楂类黑精的抗氧化活性，为解释山楂炒焦增强消食导滞作用的机理提供了一定帮助。
1.1 药材与试剂
焦山楂饮片(北京同仁堂健康药业，批号：20210401)；
无水乙醇、过硫酸钾、七水合硫酸亚铁和水杨酸(成都市科隆化学品有限公司，分析纯)；
过氧化氢(上海远大过氧化物有限公司)；
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (DPPH)(上海源叶生物科技，批号：W12A9E55779)；
2,2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐 (ABTS) (上海源叶生物科技,批号：A25GS158624)；
磷酸缓冲盐溶液(PBS)(美国Hyclone公司)。
1.2 仪器与设备
HX-200型高速中药粉碎机(浙江省永康市溪岸五金药具厂)；
AS 5150A超声波提取器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；
TU-1901双光束紫外可见光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；
Bio-Rad iMark 酶标仪(上海伯乐生命医学产品有限公司)；
H1850R离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；
10 kDa和50 kDa的Milipore超滤管(密理博中国有限公司)。
2.1 焦山楂类黑精的提取及测定方法
参考已有的类黑精提取方法[13-14]并适当改进，焦山楂饮片粉碎后过筛(粒径0.2～0.4 mm)，经超声提取后过滤，10 743 ×g离心10 min，取上清液待测。类黑精含量通常与420 nm处的吸光度值呈正相关[15]，故采用分光光度法测定样品的A420。按公式(1)计算类黑精提取量。
类黑精提取量=A420×V(mL)
(1)
注：式中V为相对液体体积，即1 g焦山楂粉末对应的液体体积
2.2 单因素实验设计
按照上述提取方法，考察各因素对焦山楂类黑精得率的影响。超声温度梯度为25℃、40℃、55℃、70℃、85℃、100℃，超声时间梯度为20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min，超声功率梯度为150 W、240 W、330 W、420 W、510 W、600 W，乙醇比梯度为0%(纯水)、20%、40%、60%、80%、100%，料液比梯度为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30。
2.3 响应面法优化提取工艺
根据上述单因素试验结果，运用Box-Benhnken设计原理进行响应面试验设计，以类黑精提取量为响应值，固定温度为25 ℃，功率为100%，以液料比、超声时间、乙醇比例为自变量，分别考察各自变量对响应值的影响并对提取条件进行优化。
2.4 超滤分离
采用响应面法优化得到的最佳方法提取焦山楂类黑精，再利用膜分离技术将焦山楂总类黑精分为三种不同分子量的类黑精[16]。使用截留分子量50 kDa和10 kDa的超滤膜将提取液分成分子量大于50 kDa的Melanoidins(High molecular weight melanoidins，H-MPRs)、10-50 kDa的Melanoidins(Medium molecular weight melanoidins，M-MPRs)和小于10 kDa的Melanoidins(Low molecular weight melanoidins，L-MPRs)，再采用分光光度法测定H-MPRs、M-MPRs和L-MPRs的类黑精含量。
2.5 焦山楂类黑精体外抗氧化能力评价
用纯水将H-MPRs、M-MPRs和L-MPRs的样品分别稀释至浓度为0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL的溶液待用。
2.5.1 DPPH自由基清除活性的测定
各样品溶液取100 μL，向其中加入DPPH乙醇溶液100 μL(其浓度为39.4 mg/L，乙醇体积分数95%)，混合均匀后放置在暗处反应时长30 min,再测定吸光度值As。同一时间，需测定100 μL的蒸馏水和100 μL的DPPH乙醇溶液混合反应后的吸光度值AC作为空白对照。96孔板每组设置3个复孔，利用酶标仪在490 nm波长下测定吸光度值。
计算公式(2)如下[17]
(2)
注：式中AS是焦山楂类黑精不同组分和DPPH自由基反应过后的吸光度值；
AC是蒸馏水和DPPH自由基反应过后的吸光度值；
A0是样品和蒸馏水混合液的吸光度
2.5.2 ABTS自由基清除能力测定
将同样体积的3.84 mg/L ABTS溶液和0.42 g/L过硫酸钾溶液混合均匀，避光放置12 h，得到ABTS混合溶液。然后将ABTS的混合物用pH=7的磷酸盐溶液进行缓冲，直到溶液在750 nm处的吸光度值为0.7±0.02，即得到ABTS 工作溶液。将25 μL各样品溶液与175 μL ABTS工作溶液混合，反应6 min。同时用200 μL蒸馏水代替提取液混匀反应体系作为空白对照组。96孔板每组设置3个复孔，利用酶标仪在750 nm波长下测定吸光度值。
计算公式(3)如下[18]
(3)
注：式中AS为焦山楂类黑精不同组分和ABTS自由基反应过后的吸光度值；
AC是蒸馏水和ABTS自由基反应过后的吸光度值；
A0是未加ABTS工作液的样品吸光度
2.5.3 羟基自由基清除活性的测定
各取1 mL样品溶液放入带塞的试管中，依次加入1 mL 0.9 g/L的FeSO4和1 mL 1 g/L的水杨酸。充分摇晃过后，再加入1 mL 30%的H2O2开始反应，水浴温度需控制在37 ℃并保持1 h。各个不同的溶液在96孔板每组设置3个复孔，利用酶标仪在510 nm波长下测定吸光度值。
计算公式(4)如下[19]
(4)
注：式中AS是焦山楂类黑精不同组分和羟基自由基反应过后的吸光度值；
AC是蒸馏水和羟基自由基反应过后的吸光度值；
A0是未加H2O2样品溶液的吸光度
3.1 焦山楂类黑精提取工艺单因素考察
如图1所示，超声温度对类黑精提取量的影响较小，考虑到实验的方便性与节约能源的原则，便将超声温度固定为25℃。随着超声功率的增加，类黑精的提取量呈现递增的趋势，所以超声功率固定为本次实验仪器功率的最大值600 W。随着料液比的减小，在1∶20处出现极大值，故选择料液比1∶15、1∶20、1∶25为后续响应面分析的3个水平。超声时间在100 min处类黑精提取量达到最大值，总体呈先增加后减小的趋势，故选择超声时间80 min、100 min、120 min为后续响应面分析的3个水平。提取溶剂中乙醇比在60%处，类黑精的提取量的转折点非常明显，出现极大值，故选择乙醇比80%、60%、40%为后续响应面分析的3个水平。
图1 单因素实验结果
3.2 响应面法优化提取工艺
基于单因素实验结果，固定焦山楂类黑精超声温度为25 ℃，固定超声功率为600 W，选择料液比、超声时间、溶剂乙醇比作为后续的响应面法优化焦山楂类黑精提取工艺的三个因素。响应面试验因素水平设计见表1，响应面分析方案与结果见表2。
表1 响应面试验因素水平设计
利用软件Design-Expert 13对表2所得数据进行分析，以焦山楂类黑精提取量为响应值，分别对A、B、C进行二项式方程拟合，得到回归模型方程为A420V=5.246 666 666 666 7-2.351 875A-0.418 5B-0.449 875C-0.256 75AB-0.121AC-0.051 25BC-2.054 583 333 333 3A2-0.838 833 333 333 33B2-0.304 083 333 333 33C2。
表2 响应面分析方案与结果
由表3可知，模型P=0.004 3，表明该回归模型有统计学意义。二项式回归方程失拟性检验不具有统计学意义(P=0.060 8)，说明该模型拟合能力良好，未知因素对实验结果干扰小，可用于分析预测焦山楂类黑精的最佳提取工艺。回归模型中F值可判断出各因素对响应值的影响，可以看出各因素对焦山楂类黑精提取量的影响大小顺序为超声时间>料液比>溶剂乙醇比。超声时间的影响程度最大(P<0.01)。
通过对表2的数据进行响应曲面分析，其结果见图2。结合二项式方程，利用软件的optimization功能预测焦山楂类黑精的最优超声提取工艺条件：超声时间选择88.50 min、溶剂乙醇比选择53.63%、料液比选择1∶17。此最佳条件下的焦山楂类黑精预测提取量为6.124。根据得出的最佳超声提取条件，将实验重复3次，焦山楂类黑精的提取量为6.08±1.6，和预测值的相对误差为1.74%。结果表明通过响应面分析所得的优化工艺是合理的。
表3 回归模型及方差分析
注：I料液比与溶剂乙醇比交互作用对焦山楂类黑精提取量的影响 Ⅱ 超声时间与溶剂乙醇比交互作用对焦山楂类黑精提取量的影响 Ⅲ 超声时间与料液比交互作用对焦山楂类黑精提取量的影响
3.3 超滤分离的H-MPRs、M-MPRs和L-MPRs的类黑精含量
在现有其它种类的类黑精研究中，发现类黑精主要是大分子量的物质[20]。故本实验将焦山楂类黑精超滤分成了高、中、低三种分子量(H-MPRs、M-MPRs和L-MPRs)的类黑精，将山楂原有的小分子化合物与炒焦过程中发生美拉德反应而来的大分子物质逐步分离。测量焦山楂类黑精在420 nm处的吸光度值，其大到小依次为H-MPRs>M-MPRs>L-MPRs(如图3所示)，H-MPRs中类黑精的含量最高说明焦山楂类黑精也主要为大分子量的物质。即焦山楂类黑精主要集中在分子量大于50 kDa的产物(H-MPRs)中。
图3 H-MPRs、M-MPRs和L-MPRs在
3.4 焦山楂类黑精体外抗氧化活性评价
不同分子量的焦山楂类黑精浓度与自由基清除率拟合曲线及半数清除率(EC50)见表4。ABTS自由基清除率越大，则表明物质的抗氧化能力越强[21]，H-MPRs、M-MPRs和L-MPRs对ABTS自由基清除率的EC50分别为0.16 mg/mL、0.22 mg/mL和0.66 mg/mL。如图4所示，对ABTS自由基清除能力由高到低依次是H-MPRs>M-MPRs>L-MPRs，且随着浓度的增加，清除能力依次增加。DPPH自由基清除率越大，表明物质抗氧化活性越高[22]，H-MPRS、M-MPRs和L-MPRs对DPPH自由基清除率的EC50分别为0.06 mg/mL、0.07 mg/mL和0.35 mg/mL。如图5所示，对DPPH自由基清除能力由高到低依次是H-MPRs>M-MPRs>L-MPRs，且随着浓度的增加，清除能力依次增加。羟基自由基清除率越大，则表明物质的抗氧化能力越强[23]，H-MPRs、M-MPRs和L-MPRs对羟基自由基清除率的EC50分别为1.09 mg/mL、1.40 mg/mL和5.95 mg/mL。如图6所示，对羟基自由基清除能力由高到低依次是H-MPRs>M-MPRs>L-MPRs，且随着浓度的增加，清除能力依次增加。如图7所示，H-MPRs、M-MPRs和L-MPRs的抗氧化活性由高到低依次是H-MPRs>M-MPRs>L-MPRs，且随着浓度的上升，抗氧化活性增加。
表4 不同分子量的焦山楂类黑精的体外抗氧化活性
图4 H-MPRs、M-MPRs和L-MPRs的ABTS自由基清除率随浓度的变化
图5 H-MPRs、M-MPRs和L-MPRs的DPPH自由基清除率随浓度的变化
图6 H-MPRs、M-MPRs和L-MPRs的羟基自由基清除率随浓度的变化
图7 不同浓度下的H-MPRs、M-MPRs和L-MPRs的抗氧化活性对比
本研究在对超声温度、超声时间、超声功率、提取溶剂乙醇比、料液比五个因素的考察基础上，通过响应面法对工艺进行优化，得出最佳的焦山楂类黑精提取工艺：温度25 ℃；
超声功率100 W；
超声时间88.50 min；
溶剂乙醇比53.63%；
料液比选择1∶17。再通过超滤分离将焦山楂类黑精提取物分成三个梯度分子量的类黑精，其类黑精含量由高到低依次为H-MPRs>M-MPRs>L-MPRs，说明焦山楂类黑精的产物主要集中在分子量大于50 kDa的H-MPRS。接着分别探究了H-MPRs、M-MPRs和L-MPRs抗氧化能力，随着类黑精含量的增加，抗氧化能力显著增强，并与浓度成正相关，说明焦山楂类黑精具有较强的抗氧化的能力。
类黑精是美拉德反应的重要产物，但其具体组成、性质和结构仍不清楚。建立类黑精的高效提取分离方法对于后续的研究是至关重要的。近年来，由于类黑精具有改善食品的色泽和风味这一特性，使其在食品领域得到广泛的研究。不仅建立了多种的类黑精提取分离办法，也出现了许多类黑精药理活性的相关报道。在中药炮制领域，如清炒法中的炒焦，也是类黑精产生的重要途径，但有关的研究较少。焦山楂是山楂经炒焦炮制而来，焦山楂在消食导滞的作用强于山楂，但山楂炮制前后药理活性变化的原因还不明确。建立高效提取分离焦山楂类黑精是解释山楂炒焦炮制机制的重要一步。在我们的体外抗氧化研究中，焦山楂类黑精体现出较强的自由基清除能力，这可能是山楂炮制前后药理活性的变化原因之一。本实验建立焦山楂类黑精的超声提取方法及其体外抗氧化能力的探究为继续深入研究山楂炮制机制奠定了基础，也为研究经清炒法炮制中药的类黑精产物提供了思路。
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