四君子汤治疗酒精性肝损伤的效果及其机制
尤红娟 李筱媛 韩亚斐 周泉 陈雪红 吕秋兰 姚如永
(1 青岛大学基础医学院医学药理学系,山东 青岛 266071; 2 青岛大学附属医院中医科; 3 青岛大学附属医院医学研究中心)
酒精性肝损伤(alcoholic liver disease,ALD)又称酒精性肝病,包括酒精性脂肪肝、肝炎、肝纤维化等［1］。近年来ALD病死率逐年升高,成为世界范围内关注的热点［2］。以往研究表明酒精导致的肠道菌群变化是诱发ALD的主要机制之一,在疾病发展中起到重要促进作用［3-4］,但目前ALD尚无针对性的治疗措施,亟需寻找防治ALD的新方案。
四君子汤源于《太平惠民和剂局方》,主要由人参、白术以及茯苓和甘草组成,具有益气健脾之功效［5］。研究发现四君子汤能够调节肠道菌群、提高肠道的免疫功能［6］,但其对ALD的防治作用尚未见相关报道。传统中医认为“肝病当先实脾”,脾气旺盛,肝疾可愈［7］。本研究基于“实脾治肝”思路,探讨四君子汤调节肠道菌群治疗ALD的疗效,为四君子汤治疗酒精性肝病提供实验依据。现将结果报告如下。
1.1 实验动物
6周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠32只,体质量19～21 g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,饲养于青岛大学附属医院SPF级实验动物中心,环境温度(20±2)℃左右,相对湿度(50±10)%,12-12 h昼夜周期。
1.2 主要试剂与药品
中药人参、茯苓、白术以及甘草购买于青岛大学附属医院药剂科(批号:SYKGQDYXGS,上药控股青岛有限公司);谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、总胆红素(T-BIL)和碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒购自深圳市迈瑞生物医药电子有限公司;体积分数0.56的乙醇溶液购自北京红星股份有限公司。
1.3 中药制备
将人参、茯苓、白术、甘草(配制比例9∶9∶9∶6)放入陶瓷锅中,用700 mL蒸馏水浸泡 1 h,武火煮沸后,改用文火熬制40 min,随后用三层纱布过滤,重复煎煮2次。然后合并水煎液,再用文火浓缩成1.0 g/mL,4 ℃下保存,使用时加热至37 ℃。
1.4 动物分组及处理
C57BL/6小鼠随机分为正常组(A组)、酒精模型组(B组)、四君子汤低剂量组(C组)和四君子汤高剂量组(D组),每组8只。各组小鼠自由进食饮水,适应环境1周后进行实验。每天8:00,B～D组小鼠灌胃体积分数0.56的乙醇溶液(6 g/kg),A组小鼠灌胃等剂量的生理盐水,同日17:00,C、D组小鼠分别灌胃5、10 g/kg的四君子汤,A、B组小鼠灌胃等剂量生理盐水。连续灌胃18 d,观察小鼠状态,每5 d记录一次小鼠体质量和摄食量。
灌胃结束后,无菌收集新鲜粪便,备用。随后所有小鼠禁食5 h,灌胃10 μL/g异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FD-4,50 g/L,相对分子质量为4 400,Sigma-Aldrich),3.5 h以后各组小鼠使用异氟烷麻醉,眼眦取血200 μL,备用。1 d后麻醉各组小鼠并摘取眼球取血,备用;断颈处死并快速解剖小鼠肝脏、脾脏备用。
1.5 小鼠肝脏指数和脾脏指数测定
准确称量各组小鼠肝脏、脾脏质量,计算肝指数以及脾指数,肝指数=肝脏湿质量/体质量×100%,脾指数=脾脏湿质量/体质量×100%。
1.6 小鼠血清生化指标检测
取各组小鼠眼球所取血液,分离血清,并使用全自动生化分析仪检测小鼠血清当中的ALT、AST、ALP、T-BIL、TG、TC水平。
1.7 小鼠肝脏和脾脏组织病理学分析
取各组小鼠肝脏和脾脏组织,用40 g/L多聚甲醛溶液固定,常规切片,按试剂盒说明书对脾脏和部分肝脏切片行苏木精-伊红(HE)染色,另一部分肝脏切片行油红O染色,光学显微镜下观察拍照。
1.8 小鼠肠道通透性检测
取各组小鼠眼眦所取血液200 μL,分离血清,以生理盐水按照1∶2比例稀释以后,在激发波长485 nm、发射波长528 nm下采用荧光分光光度计测量荧光强度。根据标准曲线,测定血液中FD-4的浓度,依据FD-4浓度变化反应肠道通透性。
1.9 肠道菌群分析
从每组中随机选取5例粪便样本,交由上海美吉生物进行16S rDNA中v3～v4区域高通量测序分析。对测序结果优化处理后按照97%相似性进行操作分类单元(OTU)聚类。根据OTU丰度,用Mothur计算随机抽样下Sobs、Shannon、Coverage指数,利用R语言工具绘制稀释曲线,反映样本测序数据量是否合理;使用Mothur软件进行α多样性分析,得到代表物种丰富度的指标Chao和代表物种多样性的指标Shannon;使用QIIME软件和R语言进行β多样性中PCoA分析并绘图。根据分类学分析结果,运用R语言工具对不同分组在门、属水平上物种组成和相对丰度进行综合性分析。
1.10 统计学处理
2.1 四君子汤对小鼠体质量、肝指数以及脾指数的影响
灌胃结束时,A组小鼠毛色黑亮,精神抖擞,行动敏捷;B组小鼠毛色暗淡发灰,精神萎靡,食欲不振;C、D组小鼠毛色鲜亮,精神状态、行动力正常。各组小鼠体质量比较差异有显著性(F=8.41,P<0.05),其中B组与A、D组比较体质量显著性降低(t=3.38、4.02,P<0.05),C组与B组体质量比较,差异无显著性(P>0.05);各组小鼠的肝指数、脾指数比较差异均有显著性(F=5.38、4.72,P<0.05),其中B组与A、D组比较小鼠的肝指数、脾指数显著升高(t=2.72～4.58,P<0.05),而C组与B组比较肝指数、脾指数差异无显著性(P>0.05)。见表1。
表1 四君子汤对小鼠体质量、肝指数以及脾指数的影响
2.2 四君子汤对小鼠肝功能和血脂的影响
各组小鼠血清中ALT、AST、ALP、T-BIL、TG和TC水平比较差异具有显著性(F=9.43～36.42,P<0.05),其中B组与A、C、D组比较小鼠血清中ALT、AST、TC水平显著增加(t=2.19～7.62,P<0.05);B组与A、D组相比较,小鼠血清中的ALP、T-BIL、TG水平均显著性升高(t=3.51～5.94,P<0.05),而C组与B组相比较,小鼠血清中的ALP、T-BIL、TG水平降低,差异无显著统计学意义(P>0.05),见表2。
表2 四君子汤对ALD小鼠肝功能和血脂指标的影响
2.3 四君子汤对小鼠肝脾形态的影响
脾脏组织HE染色结果见图1a,A组小鼠脾细胞结构完好,红髓白髓界限清晰,无明显病理形态改变;B组小鼠脾细胞结构崩解,大量细胞溶解坏死(箭头示);C组小鼠脾细胞结构趋于正常,但红髓白髓界限处有细胞溶解(箭头示);D组小鼠脾细胞结构、红髓白髓趋于正常,界限清晰,与A组比较无明显差异。
肝脏组织HE染色结果见图1b,A组小鼠肝组织结构完整,肝索排列整齐,未见明显异常;B组小鼠肝索结构紊乱,大量肝细胞气球样变,胞质空泡化(箭头示);C、D组小鼠肝索排列趋于正常,肝细胞脂肪变性明显减轻,其中A、D组形态接近一致。
肝脏组织油红O染色结果见图1c,A组小鼠肝脏无明显异常;B组小鼠肝脏中脂滴增大,数量增多,脂肪蓄积严重(箭头示);C组小鼠肝脏脂肪蓄积情况明显减轻(箭头示);D组小鼠肝脏无明显脂肪蓄积,与A组小鼠的肝脏组织几乎一致。
2.4 四君子汤对小鼠的肠道通透性的影响
A～D组小鼠的血清当中FD-4的浓度分别达到(0.21±0.04)、(0.59±0.31)、(0.44±0.19)、(0.24±0.06)mg/L;各组间比较差异具有显著性(F=7.61,P<0.05),其中B组与A、D组比较,小鼠的肠道通透性显著增高(t=3.50、3.19,P<0.05),C组与B组小鼠的肠道通透性进行比较,差异均无显著意义(P>0.05)。
2.5 四君子汤对小鼠肠道菌群多样性的影响
本研究基于Sobs指数的稀释曲线趋于平坦(图2a),说明本次测序数据量合理;基于Shannon指数的稀释曲线趋于平坦(图2b),说明本次测序数据量足够大;基于Coverage指数的稀释曲线显示整体Coverage值趋近于1(图2c),说明测序深度良好,整体覆盖率较高,能真实反映样品中的微生物群落状况。综合以上结果,本次测序数据合理,可用于后续的多样性分析。
a:基于Sobs指数的稀释曲线,b:基于Shannon指数的稀释曲线,c:肠道功群基于Coverage指数的稀释曲线
小鼠肠道菌群α多样性分析显示,各组小鼠肠道菌群Chao指数比较差异无显著性(P>0.05),见图3a;各组小鼠Shannon指数比较差异具有显著性(F=7.26,P<0.05),其中C、D组与B组进行比较,Shannon指数均显著性增高(t=4.33、4.85,P<0.05),见图3b。
a:基于Chao指数的α多样性分析,b:基于Shannon指数的α多样性,c:肠道菌群β多样性中PCoA分析
小鼠肠道菌群β多样性中PCoA分析显示,各组小鼠肠道菌群结构比较差异有显著性(R=0.29,P<0.05),其中B与A、C、D组完全分开,说明群落结构差异较大(P<0.05),A组与C、D组有重叠且距离较近,说明物种组成结构相似,见图3c。
2.6 四君子汤对小鼠肠道菌群物种组成的影响
小鼠肠道菌群门水平上物种分析显示,各组小鼠的肠道菌群主要由厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、弯曲菌门(Campilobacterota)以及放线菌门(Actinobacteriota)等组成,其中厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰度最高,约占90%。B组与A组比较,厚壁菌门相对丰度下降了9.22%,拟杆菌门相对丰度增加了12.11%,厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)下降了49.73%;D组与B组比较,厚壁菌门相对丰度增加了1.01%,拟杆菌门相对丰度降低了1.00%,F/B比值增加了3.69%。而C组与B组比较,厚壁菌门相对丰度增加了0.94%,拟杆菌门相对丰度增加了1.00%,F/B比值无明显变化,见图4a。小鼠肠道菌群属水平检测显示,B组与A组比较,Prevotellaceae_UCG-001、Alloprevotella、norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014等相对丰度增加,但是Allobaculum、Dubosiella、Bifidobacterium、norank_f_Lachnospiraceae等的相对丰度降低;C、D组较B组,Prevotellaceae_UCG-001、Alloprevotella、norank_f_norank_o_Clostridia_UCG-014等菌属含量降低,但是Dubosiella、Bifidobacterium、Allobaculum、norank_f_Lachnospiraceae等有益菌属含量增加,且D组病原菌降低以及益生菌增加更明显,见图4b。
a:小鼠肠道菌群门水平上物种组成和相对丰度柱状图,b:小鼠肠道菌群属水平上物种组成和相对丰度柱状图
历代医者认为,酒属湿热毒,酗酒则伤及脾、胃、肝、肠等,造成肝气郁结,脾胃虚弱,气血不和,生痰积热。肝脾肠三脏俱损是ALD的重要病机,健脾是疏肝的重要途径［8］。ALD发病机制之一是酗酒导致肠道微生物变化,与中医酒湿伤脾有异曲同工之处［9］。四君子汤是健脾祛湿的代表方剂,其调节肠道菌群的作用［10］,可能有助于防治ALD。本研究通过建立小鼠ALD模型,围绕肠道菌群变化探讨四君子汤对小鼠ALD的防治作用。
体质量和脏器指数是反映身体健康状况的指标之一［11］,而肝脏和脾脏的病理检查是反映肝脾细胞损伤程度的最直观的证据,也是临床诊断常用的金标准［12］。此外血清中ALT、AST、ALP、T-BIL水平反映肝损伤程度,TG和TC水平反映脂质堆积情况。当肝脏受到酒精、病毒等因素刺激后,ALT和AST会大量释放至血液中［13］。本研究发现,酗酒可导致小鼠肝脾脏器肿大,体质量显著下降而肝脾指数明显升高;同时,B组与A组相比较,血清中ALT、AST、ALP、T-BIL、TG、TC水平显著升高。HE染色结果显示,B组小鼠肝脏损伤最为严重,出现肝索结构紊乱,肝细胞气球样变,脾组织细胞结构崩解坏死。油红O染色显示,B组小鼠肝脏内呈现油红O着色,提示肝脏脂肪蓄积和脂肪变性情况严重。而四君子汤的干预可增加小鼠的体质量,降低肝脾指数,降低血清中的ALT、AST、ALP、T-BIL、TG、TC水平,改善肝脏脾脏的病理损伤。表明四君子汤可以对小鼠ALD起到了一定的防治作用。
大量研究证实肠道微生物与ALD发生发展密切相关［14］。由于酒精摄入引起肠道菌群失调,进而导致肠道黏膜屏障受损,肠道通透性增加,从而影响肝脏功能［15］。本研究通过检测肠道通透性以及肠道菌群变化,来进一步判断四君子汤是否是通过该途径改善肝脏损伤。本研究发现B组与A组比较,小鼠肠道通透性显著增高,与WANG等［16］研究结果类似;而C、D组与B组比较肠道通透性明显改善。肠道菌群的检测结果也显示B组小鼠肠道菌群α多样性明显低于A组,与FAN等［17］研究结果相似;C、D组菌群多样性以及丰富度高于B组。本研究肠道菌群β多样性分析结果表明,C、D组肠道微生物分布与A组相似度高,且均与B组差异较大,与LENG等［18］研究结果一致。酒精及其代谢产物会影响肠道菌群组成,导致菌群失调［19］。本研究发现,B组较A组在肠道菌群门水平上可使拟杆菌门相对丰度升高,厚壁菌门相对丰度降低,厚壁菌门与拟杆菌门比值降低,与LIU等［20］结果类似;在属水平上,酒精过量摄入使B组中Prevotellaceae_UCG-001、Alloprevotella等菌属显著富集但是Allobaculum、Dubosiella、Bifidobacterium的相对丰度降低。其中Prevotella_UCG-001是机会性致病菌,与肠炎、肝炎及代谢紊乱等疾病相关［21］。Alloprevotella属于革兰阴性杆菌,与牙周炎、直肠炎等多种疾病相关［22-24］。在给予四君子汤后,肠道微生物变化明显。D组小鼠肠道菌群门水平上较B组拟杆菌门丰度降低,F/B比值增加;C组较B组厚壁菌门丰度升高,而拟杆菌门也升高,具体机制尚需进一步探讨。小鼠肠道菌群属水平上C、D组较B组Prevotellaceae_UCG-001、Alloprevotella菌属含量降低,推测四君子汤具有缓解肠道炎症的潜在益处;而Dubosiella、Bifidobacterium、Allobaculum等有益菌属含量增加;其中D组致病菌降低以及有益菌升高更为显著。Dubosiella具有参与调节身体代谢、提高肠道免疫力、改善肥胖症状以及改善酒精性肝损伤等作用［25］。Bifidobacterium在调节肠道菌群结构、限制肠道潜在致病菌黏附和过度生长、改善肠黏膜屏障功能等方面均能够发挥重要作用［26］。Allobaculum作为短链脂肪酸产生菌在改善肠屏障的完整性方面起着重要作用［27］。本研究结果表明,四君子汤通过改善肠黏膜屏障,降低肠道通透性,调节菌群多样性,增加Dubosiella、Bifidobacterium、Allobaculum等有益菌,减少致病菌,从而改善酒精性肝损伤,符合“肝病要实脾”的理念。
总之,本研究显示,四君子汤可有效改善酒精诱导的肝损伤,其作用机制包括改善肝功能、调节脂类代谢、改善肠道黏膜屏障,增加肠道菌群多样性、提高Dubosiella、Bifidobacterium、Allobaculum等有益菌含量等多种途径,具有显著的多途径、多效应优势。本研究围绕肠道菌群变化,揭示四君子汤通过“实脾”达到“治肝”的作用,为探索中药方剂对酒精性肝病的防治提供了新思路。
伦理批准和动物权利声明：本研究涉及的所有动物实验均已经通过了青岛大学附属医院实验动物福利伦理委员会的审核批准(文件号AHQU-MA-L20200626)。所有实验过程均遵照《实验动物管理条例》进行。
作者声明：尤红娟、韩亚斐、周泉、吕秋兰参与了研究设计;李筱媛、陈雪红、姚如永、尤红娟参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文,且均声明不存在利益冲突。
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