不同种植年限对特殊药材土壤化学性质和微生物多样性的影响
张英英，魏玉杰，吴之涛，杨宪忠
(1.甘肃省农业工程技术研究院，甘肃 武威 733006；
2.甘肃省特种药源植物种质创新与安全利用重点实验室，甘肃 武威 733006；
3.武威市祁连山区道地中药材生态栽培技术创新中心，甘肃 武威 733006)
特殊药材包含吗啡、可待因等30多种生物碱[1]，是重要的药源植物，其果实的乳汁、果壳、种子嫩苗均可入药，有镇痛、镇静、止咳等多种药用功效。生产上特殊药材采用封闭式管理，在同一地块连续种植十余年，导致土壤理化性质恶化，霜霉病等病害频发，使植株长势变弱，产量和品质下降，这已成为影响特殊药材规范化栽培和生产的重要问题。特殊药材轮作倒茬在实际生产中难以运用，连作模式难以避免，深入了解特殊药材连作障碍的产生机理，探索能够缓解或克服其连作障碍的有效方法已成为特殊药材种植过程中亟待解决的关键问题。
连作障碍是多种原因共同作用的结果，前人研究发现造成连作障碍的原因有以下3点：一是土壤养分失衡，有害代谢产物积累，矿质元素含量发生变化，特别是随种植年限的增加，养分供给不平衡，微生物种群失衡，导致土壤质量严重下降[2]；
二是连作后土壤微生物结构及多样性的变化，导致土壤性质恶化，微生物群落结构失衡，主要表现为根际土壤微生物由细菌型向真菌型发展[3]；
三是药材自身根系分泌物的毒害作用，植株地上部和根系会分泌出某些特殊物质抑制其生长和发育，产生自毒作用，包括酸类、酯类等已被报道的化感自毒物质很容易在土壤中积累，造成土壤理化性质恶化并对植株的生物膜系统及保护酶系统造成损害，特别是随着连作年限增加，根系分泌物增加，使得根际微生物群落失调，植株抗逆能力下降，根际环境逐渐变为酸性，有利于真菌的生长而细菌数量则逐渐减少[4-5]。药用植物与根际微生物之间存在着复杂的相互作用关系，药用植物通过根系分泌物对根际微生物的多样性和丰富度产生影响，而根际微生物的代谢产物对药用植物的生长发育、营养吸收、抗病能力、品质等都有重要的影响[4,6]。目前，对于药用植物连作障碍的研究主要集中在地黄、三七、人参等方面[6-8]，引起连作障碍的原因也不尽相同。虽然各种缓解连作障碍的种植模式被不断提出，但关于药用植物连作障碍产生的机制以及根际微生物克服或缓解连作障碍的机制等问题还需更深入的研究。
本研究从药用植物-土壤-微生物的互作关系方面入手，利用lluminaNovaSeq高通量测序技术，对不同种植年限特殊药材根际土壤微生物群落结构和多样性进行深度研究，并揭示根际微生物、环境因子之间的相互关联及其互作效应，为克服特殊药材种植引起的连作障碍提供理论依据。
1.1 试验概况及土壤样品的采集
试验地位于平原和沙漠戈壁边缘交汇地带，平均海拨1 700 m，年平均气温约7.6℃，多年平均降水量约190 mm，年蒸发量约2 400 mm，年均日照时数2 724.8 h，年降水分布不均，主要集中在5—9月。试验区土壤为灌漠土，试验共设4个处理：种植特殊药材1 a(Y1)，连续种植特殊药材4 a(Y2)，连续种植特殊药材24 a(Y3)，试验地均属同一封闭区域的相邻地块，因特殊性统一封闭管理，种植、施肥及其他管理措施保持一致，肥料种类及用量均一致；
对照(CK)为同一封闭区域没有种植过特殊药材的相邻地块，当年施肥量与其他处理一致。于开花期每个处理样地随机选取15株特殊药材，收集根系表面0～5 mm的土壤，混合均匀，一部分保存于-80℃低温冷冻用于DNA提取，一部分风干后用于土壤理化性质测定，一部分4℃冰箱保存，用于土壤硝态氮和铵态氮含量测定。
1.2 土壤理化性质测定
有机质、pH值、电导率、全氮、碱解氮、全磷、有效磷、速效钾、有效态铜、有效态锌、有效态铁、有效态锰均参照鲍士旦等[9]的相关标准方法进行测定；
铵态氮、硝态氮分别用土壤铵态氮、土壤硝态氮试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司生产)提取，SP-765型紫外可见光分光光度计(上海光谱仪器有限公司)测定。
1.3 土壤DNA提取和高通量测序
土壤微生物DNA提取：每个土样分别称取0.500 g，3次重复，用PowerSoil©DNAIsolationKit试剂盒提取土壤微生物基因组总DNA。所有土壤样品的细菌16SrDNAV3+V4区扩增用引物338F(5"-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3")和引物806R(5"-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3")进行，所有土壤样品的真菌ITS1F-ITS2R区扩增用引物ITS1F(5"-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3")和ITS2R(5"-GCTGCGTTCT-TCATCGATGC-3")进行，PCR产物由AMPureXTbeads(BeckmanCoulterGenomics，Danvers，MA，USA)纯化，Qubit(Invitrogen，USA)定量。扩增子池用于测序，扩增子文库的大小和数量分别在Agilent 2100生物分析仪(Agilent，美国)和Illumina(KapaBiosciences，Woburn，MA，美国)的文库定量试剂盒上进行评估。在NovaSeq PE250平台上对库进行排序。样品在Illumina NovaSeq平台上进行测序，测序由TSINGKE提供。建库和测序工作委托北京擎科生物科技有限公司完成。
1.4 测序数据处理与分析
使用Trimmomatic v 0.33软件，对测序得到的RawReads进行过滤，然后使用Cutadapt 1.9.1软件进行引物序列的识别与去除，得到不包含引物序列的CleanReads；
再使用Usearchv 10软件，通过overlap对每个样品的CleanReads进行拼接，然后根据不同区域的长度范围对拼接后数据进行长度过滤，使用UCHIMEv 4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据(Effective Reads)。划分OTUs，进行多样性分析、差异分析、相关性分析。
1.5 统计分析
利用SPSS 19.0软件，采用单因素方差分析方法，检验土壤化学性质及高通量测序得到的微生物丰富度、多样性指数之间的差异。检验水平为α<0.05。
2.1 不同种植年限对特殊药材根际土壤化学性质及微量元素的影响
由表1可知，不同种植年限对特殊药材根际土壤的pH没有显著影响，但与CK相比，各处理均有下降。全氮、碱解氮、全磷、速效钾、有效态铁和有效态锰均表现为Y1处理显著高于其他处理。有机质含量Y1显著高于Y3与CK，与Y2差异不显著。有机质、全氮、碱解氮、铵态氮、全磷、有效磷、有效态铜、有效态铁、有效态锰含量整体均随种植年限增加呈现先增后降趋势。电导率与硝态氮均表现为Y3处理显著高于其他处理，电导率分别为CK、Y1、Y2处理的7.20倍、4.26倍、2.00倍，硝态氮分别为CK、Y1、Y2处理的21.28倍、8.13倍、3.61倍，随着种植年限增加表现出明显的增加趋势，均表现为Y3>Y2>Y1>CK；
速效钾表现为CK显著低于Y1、Y3处理，与Y2处理差异不显著，有效态锌表现为Y1、Y2、Y3显著高于CK，2个指标均表现为Y1>Y3>Y2>CK。
表1 不同种植年限对特殊药材根际土壤化学性质及微量元素的影响Table 1 Effects of different cropping years on soil chemical properties and trace elements of special medicinal rhizosphere soil
2.2 不同种植年限对特殊药材根际土壤微生物α-多样性指数的影响
α-多样性指数是反映微生物群落丰富度和均匀度的综合指标。由表2可知，细菌Coverage指数为0.9969～0.9970，真菌Coverage指数为0.9994～0.9997，表明其测序结果能够全面反映土壤细菌和真菌的多样性。不同种植年限对特殊药材土壤细菌α-多样性指数均无显著影响，但Chao1指数、Simpson指数、Shannon指数均表现为CK高于其他处理。除Chao1指数外，ACE指数、Shannon指数、Simpson指数均随着种植年限增加呈先增后降趋势，土壤细菌丰富度和多样性减少。真菌α-多样性指数中ACE指数Y3显著高于Y1、Y2，Chao1指数为Y3显著高于Y1，Simpson指数、Shannon指数各处理间差异均不显著。真菌α-多样性指数均随着种植年限先降后升，其中除Simpson指数外，Y1处理其余真菌α-多样性指数均最小，后随种植年限增加土壤真菌丰富度和多样性增加。
表2 不同种植年限对特殊药材根际土壤微生物α-多样性指数的影响Table 2 Effects of different cropping years on microbial α-diversity index in rhizosphere soil of special medicinal materials
2.3 不同种植年限对特殊药材根际土壤微生物群落OTU群落聚类的影响
如图1A、1B所示(见155页)，不同种植年限特殊药材根际土壤细菌和真菌OTU数量存在一定差异，CK、Y1、Y2、Y3处理土壤细菌OTU数量分别为768、653、661、758，共有的土壤细菌OTU数量为467，CK、Y1、Y2、Y3特有OTU数量分别为79、38、30、81。CK、Y1、Y2、Y3处理土壤真菌OTU数量分别为334、293、315、356，共有的土壤真菌OTU数量为141，CK、Y1、Y2、Y3特有OTU数量分别为61、9、16、65。真菌和细菌群落特有OTU数量均为Y3处理最高，细菌、真菌群落OTU数量随种植年限增加先降低后增加。
图1 不同种植年限特殊药材根际土壤细菌和真菌群落的OTU韦恩图Fig.1 Venn diagram based on OTU of bacterial and fungal communities in rhizosphere soil of special medicinal materials with different cropping years
2.4 不同种植年限特殊药材根际土壤微生物门水平上的群落组成
不同种植年限特殊药材根际土壤细菌共有22门47纲106目187科380属415种。其中细菌门水平上的群落组成及相对丰度如图2A(见155页)所示，细菌门水平前10位基本一致，分别为Proteobacteria(变形菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)、Gemmatimonadetes(芽单胞菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Rokubacteria(己科河菌门)、Nitrospirae(硝化螺旋菌门)、Planctomycetes(浮霉菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)，其他类群的相对丰度占比为0.62%～3.61%。Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria为优势菌门，其中Proteobacteria在CK、Y1、Y2、Y3处理中的相对丰度分别为35.77%、40.03%、39.08%、41.30%，Y3最高，CK最低；
Acidobacteria相对丰度分别为25.44%、12.36%、17.48%、15.12%，CK显著高于Y1和Y3；
Actinobacteria相对丰度分别为10.89%、16.86%、9.24%、12.74%，各处理间差异不显著。在Chloroflexi 中Y1、Y2、Y3均高于CK，分别提高了45.91%、100.64%、39.00%，Y2与CK差异显著；
Bacteroidetes中Y1显著高于CK，Rokubacteria中CK显著高于Y1和Y3；
与CK相比，Proteobacteria、Chloroflexi、Bacteroidetes相对丰度均升高，Acidobacteria、Rokubacteria相对丰度均降低。
不同种植年限特殊药材根际土壤真菌共有12门25纲56目112科176属189种。其中真菌门水平上的群落组成及相对丰度如图2B(见155页)所示，真菌优势菌门前3位基本一致，分别为Mortierellomycota(被孢霉门)、Ascomycota(子囊菌门)、Basidiomycota(担子菌门)，其他类群的相对丰度占比为1.61%～11.86%。其中Mortierellomycota在CK、Y1、Y2、Y3处理中的相对丰度分别为49.64%、69.16%、54.21%、41.83%，Y1最高，Y3最低；
Ascomycota相对丰度分别38.33%、23.92%、26.65%、41.28%；
Basidiomycota相对丰度分别8.87%、5.30%、7.28%、10.27%，上述优势菌门各处理间差异均不显著。其他类群中Olpidiomycota Y2处理显著高于其他处理，Chytridiomycota Y3处理显著高于Y1、CK处理。除CK外，其余各处理Mortierellomycota相对丰度随种植年限增加呈降低趋势，表现为Y1>Y2>Y3；
Ascomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota相对丰度随种植年限增加而增加，均表现为Y3>Y2>Y1。
图2 不同种植年限特殊药材根际土壤微生物群落组成在门水平上的相对丰度Fig.2 Relative abundance of rhizosphere soil microbial community composition of special medicinal materials at phylum level in different cropping years
2.5 不同种植年限特殊药材根际土壤微生物属水平上的群落组成
如图3A所示，不同种植年限特殊药材根际土壤细菌优势属前10位基本一致，包括Sphingomonas(鞘氨醇单胞菌属)、未知菌RB41、Lysobacter(溶杆菌属)和7种不可培养的未知菌属。其他属在CK、Y1、Y2、Y3处理中的相对丰度分别为56.56%、60.19%、58.04%、60.22%。优势菌属Sphingomonas在CK、Y1、Y2、Y3处理中的相对丰度分别为5.33%、9.28%、10.53%、13.07%，Y2、Y3显著高于CK。Subgroup6在各处理的相对丰度分别为11.52%、5.62%、7.83%、7.44%，CK显著高于Y1。Gemmatimonadaceae在各处理的相对丰度分别为5.38%、4.26%、5.70%、5.11%，各处理间差异不显著；
RB41相对丰度分别为6.92%、2.99%、1.99%、1.38%，CK处理显著高于其他处理。Xanthomonadaceae相对丰度分别为1.19%、3.32%、3.08%、4.65%，Y1、Y3处理显著高于CK；
Lysobacter相对丰度分别为1.95%、2.22%、1.61%、1.31%，Y1显著高于Y3。其他未知菌属间差异不显著。总体上，Sphingomonas、Xanthomonadaceae相对丰度随着种植年限增加呈明显上升趋势，RB41呈下降趋势，Lysobacter呈先升后降趋势。
如图3B所示，在属水平上土壤微生物真菌群落种类变化及相对丰度存在差异，4个处理中Mortierella(被孢霉属)和Fusarium(镰刀菌属)是优势种群，Mortierella在CK、Y1、Y2、Y3处理中的相对丰度分别为49.54%、68.81%、53.86%、32.94%，各处理间差异不显著；
Fusarium在各处理的相对丰度分别为16.67%、4.18%、9.78%、22.34%，其中Y3显著高于Y1、Y2，与CK不显著。Solicoccozyma在各处理的相对丰度分别为2.89%、4.18%、2.41%、0.06%，Y1显著高于Y3；
Y2处理中Olpidium相对丰度达到7.86%，显著高于其他处理；
Y1处理Thelebolus相对丰度达到5.43%，显著高于其他处理；
Schizophyllum、Cladosporium、Aspergillus在Y3中的相对丰度分别为3.31%、0.80%和1.44%，均高于其他处理。Mortierella、Solicoccozyma、Thelebolus相对丰度均随种植年限增加呈先增加后下降趋势，Fusarium、Schizophyllum、Cladosporium、Aspergillus相对丰度均随种植年限增加呈先减少后增加趋势。
图3 不同种植年限特殊药材根际土壤微生物群落组成在属水平上的相对丰度Fig.3 Relative abundance of rhizosphere soil microbial community composition of special medicinal materials at genus level in different cropping years
2.6 土壤微生物群落PCoA分析
细菌群落PCoA分析结果表明(图4A)，群落组成的变异受11个主坐标成分的控制，主坐标成分的特征值均大于0.523，其中前2个主坐标成分影响最大，PC1和PC2分别解释38.64%和24.08%的方差变异，二者累计贡献率为62.72%；
PC1主坐标成分可将CK的细菌群落与Y1、Y2、Y3明显区分开，PC2可将Y3与CK、Y1、Y2明显区分开。除Y1外，其余处理组内变异均较小。真菌群落PCoA分析结果表明(图4B)，群落组成的变异受11个主坐标成分的控制，主坐标成分的特征值均大于1.146，其中前两个主坐标成分影响最大，PC1和PC2分别解释32.87%和17.22%的方差变异，二者累计贡献率为50.09%，各处理间组间差异较大，但PC1处理能区分不同种植年限的真菌群落变化。
图4 土壤微生物群落PCoA分析Fig.4 PCoA analysis of soil microbial community
2.7 环境因子对根际土壤微生物群落的影响
细菌群落RDA分析结果表明(图5A)，RDA1和RDA2分别解释29.85%和21.59%的方差变异，二者累计贡献率为51.44%。土壤细菌群落主要受pH、电导率、硝态氮、有效磷、速效钾的影响较大。其中，Acidobacteria、Rokubacteria、Nitrospirae与pH呈正相关，与其他环境因子呈负相关；
土壤硝态氮和有效磷是影响Chloroflexi、Gemmatimonadetes、Planctomycetes的主要环境因子；
Proteobacteria与pH呈负相关，与其他环境因子均呈现正相关；
Firmicutes、Actinobacteria、Bacteroidetes与有机质、全磷、碱解氮、速效钾呈正相关。
真菌群落RDA分析结果表明(图5B)，RDA1和RDA2分别解释32.23%和16.91%的方差变异，二者累计贡献率为49.14%。土壤真菌群落主要受pH、电导率、硝态氮、有效磷、全磷、铵态氮、碱解氮、有机质的影响较大。Basidiomycota、Ascomycota、Chytridiomycota、Mucoromycota与电导率和土壤硝态氮呈正相关，Olpidiomycota与有效磷呈正相关；
pH与Monoblepharomycota、Rozellomycota、Glomeromycota呈正相关，与其他环境因子呈负相关;Zoopagomycota、Kickxellomycota与有机质、全氮、全磷、碱解氮、速效钾、铵态氮呈正相关。
注：OM—有机质；
TP—全磷；
TN—全氮；
AN—碱解氮；
AK—速效钾；
AP—有效磷；
EC—电导率；
硝态氮；
铵态氮。Note：OM-Organic matter；
TP-Total phosphorus；
TN-Total nitrogen；
AN-Alkaline nitrogen；
AK-Availablepotassium；
AP-Available phosphorus；
EC-Electrical nitrogen.图5 土壤理化性质与微生物群落RDA分析Fig.5 RDA analysis of soil physical and chemical properties and microbial community
3.1 种植年限对土壤理化性质的影响
连作障碍效应突出表现在土壤性质恶化、养分失衡、微生物区系变化，病虫害频发及自毒作用严重等方面[2-4]。本研究表明随着种植年限增加，土壤pH较对照下降，这与前人在附子、枸杞等[10-11]中药材连作研究的结果相一致。可能是连作导致土壤养分失衡，硝态氮大量积累，从而导致pH下降。本研究表明土壤有机质、碱解氮、铵态氮、全磷、有效磷及微量元素含量均随种植年限增加而呈现先增后降的趋势，电导率和硝态氮含量随种植年限增加而明显增加。土壤硝态氮过量富集，直接导致土壤次生盐渍化、养分失衡、土壤结构破坏等问题[12]，这与丛微等[8]对人参连作土壤硝态氮含量显著增加，影响人参吸收硝态氮的研究结果相一致。但王娟英等[13]研究认为怀牛膝连作土壤全磷、碱解氮、速效磷和速效钾含量上升，而全氮、全钾并无明显变化。上述药用植物连作后对土壤理化性质的影响均与本研究结果存在差异，原因可能是不同药用植物对养分的需求不同，养分吸收规律存在差异，长期连作可能会造成某些土壤营养元素缺乏或富集，导致土壤养分失衡[7]；
另外不同地区、不同种类的药用植物管理措施不同，施用的肥料种类、数量及土壤性质有较大差异，连续的化肥过量施用打破养分平衡，可能导致土壤酸化，理化性质变劣，加剧了根系化感自毒作用，根系产生的自毒化感物质对土壤微生物种群数量、结构产生不利影响[14]，这可能是造成连作障碍的重要原因。但有研究认为土壤理化性质改变不是导致连作障碍的主导因子[15]，连作也可能改善土壤根际微环境，提高土壤养分状况[13]。因此，不同药用植物连作对土壤理化性质的影响存在差异。
3.2 种植年限对土壤微生物多样性和群落结构的影响
不同种植年限的特殊药材土壤细菌α-多样性中ACE指数、Shannon指数、Simpson指数均随着种植年限的增加呈先增后降趋势，真菌α-多样性中ACE指数、Chao1指数Y3显著高于Y1，真菌α-多样性指数均随着特殊药材种植年限先降低后增加，土壤真菌丰富度和多样性增加，土壤细菌丰富度和多样性减少。这与地黄[6]、枸杞[11]、丹参[16]连作的研究结果基本一致，均表现为连作使土壤细菌群落微生物多样性减少。但李晶晶等[17]研究认为随种植年限增加，设施百合红壤中细菌Shannon指数、Simpson指数显著升高，真菌Shannon指数、Simpson指数显著下降，连作可能导致土壤细菌微生物种群多样化。这与本研究结果相反，可能与土壤类型、作物种类、栽培措施等不同有关。
土壤微生物群落失衡是导致药用植物连作障碍的重要原因[3-5]。本研究表明不同种植年限特殊药材根际土壤细菌群落门水平Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria为优势菌门，Proteobacteria与Actinobacteria各处理间差异不显著，二者均为碱性土壤中的优势菌门，广泛存在于各种类型土壤中，适应性较强[18]。Acidobacteria随着种植年限增加相对丰度下降，前人研究表明酸杆菌门在动植物残体多聚物及纤维素降解、铁循环、单碳化合物代谢等方面具有重要作用[19]，丛微等[8]研究认为酸杆菌门相对丰度的减少可能导致土壤中硝酸盐、亚硝酸盐和铁等金属含量的增加，不利于人参的生长，这与本研究结果相似。而李晶晶等[17]对设施百合连作研究认为酸杆菌门丰度随连作年限增加而上升，变形杆菌和放线菌门的丰度则随连作年限的增加呈下降趋势，这与本研究结果存在较大差异，可能与作物种类、土壤类型不同相关。
本研究表明不同种植年限土壤细菌群落优势菌属分别是Sphingomonas、未知菌RB41、Lysobacter等，Sphingomonas、Xanthomonadaceae随着种植年限增加呈明显上升趋势。研究表明鞘氨醇单胞菌能够耐受贫瘠和恶劣环境，其特殊的代谢调控机制能抵抗外界不利的环境变化，也能降解土壤中的有毒物质[20]；
连作引起的土壤养分失衡及土壤性质恶化，可能激发鞘氨醇单胞菌防御机制和生物代谢，使其相对丰度增加。本研究还表明，连作使Xanthomonadaceae相对丰度明显增加，Lysobacter相对丰度下降，与地黄、附子等[6,10]中药材连作后土壤微生物群落变化研究结果相似，Xanthomonas致病形式多样，侵染范围广，而Lysobacter对病原真菌等有突出的拮抗作用，在生物防治病原菌和线虫方面优势明显[21]。因此，土壤有益细菌减少、有害细菌增加是影响特殊药材连作的重要原因，因现有分析手段有限，本研究还有很多未知属种需进一步深入探究。
本研究表明土壤真菌群落门水平Mortierellomycota相对丰度随种植年限增加呈先增后降趋势，Ascomycota、Basidiomycota、Chytridiomycota随种植年限增加而明显增加。土壤真菌群落属水平Mortierella、Solicoccozyma、Thelebolus均随种植年限增加呈先增后降趋势，Fusarium、Cladosporium、Aspergillus均随种植年限增加呈先降后增趋势。大多研究认为，根际土壤中的病原微生物是植物发生土传病害的主要来源，Yuan等[22]研究认为发病土壤中Ascomycota的相对丰度更高，而在健康土壤中Mortierellomycota更多，较高的尖孢镰刀菌相对丰度是发病土壤的一个重要特征，而某些被孢霉真菌参与有机物料的降解，在提升产量以及改善土壤质量方面具有重要作用[23]。栽培人参土壤优势真菌为子囊菌门、担子菌门，人参连作导致子囊菌门的相对丰度增加[24]，二者是分解土壤中纤维素、降解高木质素的关键菌群[25]，可能会促进微生物及周围环境对植物组织的破坏，进而引起植物病害。镰刀菌属是引起农作物病害的重要病原真菌之一，其侵染寄主范围较广，可引起作物根、茎、叶等腐烂，能产生真菌毒素等多种次生代谢产物，导致作物发病减产[26]，这可能是引起特殊药材连作障碍的重要原因。王悦等[27]认为镰刀菌属是丹参枯萎病和根腐病的主要病原菌，刘世鹏等[10]研究认为附子连作后镰刀菌属和木霉属丰度增加，真菌群落结构失衡，致使附子减产。而枝孢属能寄生植物地上部分引起植物病害，是常见的病原真菌[28]。慕东艳等[29]对黑龙江省药用植物根际土壤真菌多样性调查认为Aspergillus、Fusarium是14种药用植物根际土壤真菌的优势菌群，曲霉属真菌是药材主要污染菌之一[30]。因此，Mortierella等有益真菌减少，Fusarium、Cladosporium、Aspergillus等有害真菌的增加可能是导致特殊药材微生物菌群失衡、发生连作障碍的重要原因。
3.3 环境因子对根际土壤微生物群落的影响
本研究结果表明土壤细菌群落受pH、电导率、硝态氮、有效磷、速效钾的影响较大；
土壤真菌群落受pH、电导率、硝态氮、有效磷、全磷、铵态氮、碱解氮、有机质的影响较大。Basidiomycota、Ascomycota、Chytridiomycota、Mucoromycota与电导率和土壤硝态氮呈正相关。连作可能影响土壤理化性质及根系微生物生长代谢，使根系微生态环境发生改变，有害微生物及致病菌增加，土壤pH、硝态氮、电导率等理化性质改变是影响特殊药材连作土壤微生物群落变化的重要因素。
随着种植年限增加，特殊药材根际土壤细菌丰富度和多样性减少，土壤真菌丰富度和多样性增加，Sphingomonas、Xanthomonadaceae等相对丰度明显上升，未知菌属RB41、Lysobacter相对丰度下降。Fusarium、Cladosporium、Aspergillus等有害真菌相对丰度呈先降后升趋势，Fusarium相对丰度增加是导致特殊药材连作障碍的重要原因。特殊药材连续种植24 a后，电导率与硝态氮含量显著高于其他种植年份，土壤pH、硝态氮、电导率等理化性质改变是影响特殊药材连作土壤微生物群落变化的重要因素。
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