秀珍菇上一种黏菌的鉴定及其防治初探

胡积祥 徐 明 高 波 王 凡 蒋颖洁 张俊喜*

（1江苏沿海地区农业科学研究所，江苏盐城 224002；
2盐城市雨露农业科技有限公司，江苏盐城 224002）

秀珍菇即肺形侧耳Pleurotus pulmonarius[1]，是一种深受消费者喜食的高蛋白低脂肪的食用菌，具有极高的营养价值及得天独厚的抗病养生功效。秀珍菇的多糖具有抗炎[2]、镇痛[3]、降血压[4]和控制糖尿病[5]的疗效，对肝癌具有预防和化疗增效作用[6]，可以改善因饮食高脂肪而造成的脑海马区域的损害和失忆现象[7]；
其漆酶可用于纺织工业中染料的脱色[8]、食品和饲料中真菌毒素的解毒[9]、土壤修复中清除二噁英、呋喃等有毒化学物质[10]。

近几年，江苏省秀珍菇产业发展较快，年栽培量至少2 000 万袋，主要分布在常州、淮安、连云港、泰州和盐城等市，其中盐城市达100万袋以上，年产值1 亿元以上。栽培秀珍菇往往是在全年气温较高时6-9 月出菇，因此除极易受木霉、菇蝇和菇蚊[11]等为害外，还时常遭受黏菌的侵害。出菇棚一旦出现黏菌，如不采取有效防治措施，产量将遭受毁灭性的损失。

2018 年，江苏省盐城市秀珍菇菇棚内出现一种黏菌，该菌吞噬秀珍菇的菌丝和子实体，且生长和扩展迅速，水解胶化菇体能力强，一旦子实体被感染，72 h 内将变为一摊黄色的胶状水。据2022 年的调查，盐城市秀珍菇菇棚的产量因其损失近三分之一，给当地的生产者造成了巨大的经济损失。为此，笔者对该黏菌进行纯化分离和鉴定，初步探讨了一种防治方法，以期为防控秀珍菇黏菌提供一定参考。

1.1 试验材料

（1）培养基

燕麦琼脂培养基：1 L 蒸馏水中加30 g 燕麦片，煮沸1 h 后用三层纱布过滤，取滤液加入20 g 琼脂粉，加热溶解后定容1 L，121 ℃灭菌20 min。

（2）供试菌株

黏菌YCTH 于2022年6月采自盐城市亭湖区南洋镇月青村，雨露农业科技有限公司的菇棚。

（3）主要试剂和药剂

2× 超 光 速PCR mix（MF848）、M5 HiClear DL2000 plus DNA marker（MF026）、M5 HiPure Agarose 琼脂糖（MF103）和M5 HiPure Gelred 核酸染料（MF079）均购自北京聚合美生物科技有限公司；
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、氯仿、异丙醇和乙醇均为国产分析纯；
二氧化氯消毒片（规格为100 g：12.0 g），由南京水立美生物科技有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离和培养

利用黏菌的移动性，挑取受害菌盖上的黄色原生质体至燕麦琼脂培养基平板中心，于24 ℃黑暗培养24 h 后，切取最前段纯净的菌丝体至新的燕麦琼脂培养基平板上，如此重复移切，直到菌株纯化。此后每两天向平板中撒约0.5 g 无菌燕麦片覆盖部分培养基，并加无菌水湿润燕麦片。

1.2.2 菌株分子鉴定

刮取培养基平板中燕麦片上的原生质体，以CTAB 法提取其基因组总DNA；
利用引物ITS-F（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS-R（TCCTCC GCTTATTGATATGC）PCR 扩增黏菌ITS 序列[12]，其中PCR 扩增体系和程序参照试剂说明书，退火温度为45 ℃。PCR 产物委托北京六合华大基因科技有限公司进行测序，测序结果在NCBI 上进行Blast 检索，下载同源性较好的序列后利用MEGA 11中最大似然法构建系统发育树，重复1 000 次，其他参数默认。其中序列比对采用内嵌程序ClustalW，外群菌株选择为鳞钙皮菌，GenBank 中登录号为HQ450508.1。

1.2.3 二氧化氯防治试验

参照卢成苗等[13]采用室内层架式栽培‘台秀57’，棚中铁架长3.5 m，宽0.6 m，高3 m，分三层，每层80 袋。聚丙烯塑料袋的规格为17 cm × 33 cm ×0.005 cm；
培养料为杂木屑72%，麸皮20%，玉米粉5%，石膏粉1.5%，石灰1.5%。

将10 g 二氧化氯消毒片投入1 kg 水中，稀释成0.12%（质量比）的工作液。当秀珍菇的菌盖长至约3 cm，菌柄2 cm 时，选取铁架中层最上面的20 个菌袋；
将带菌的燕麦片贴在菌盖上近菌柄处的一侧，每个菌袋处理2～3 个菌盖；
6 h 后将这些菌袋纵向割开，一半喷清水作为对照，另一半与同一菇架上的其他菌袋一起喷（雾状）二氧化氯工作液，此时对照组用塑料袋短暂遮盖；
12 h 后测量菌盖上黏菌原生质体前端离燕麦片的距离，即迁移距离。

2.1 为害特征

堆料被黏菌侵染后，料面会出现鲜黄色的扇面形胶状体，其多分枝而脉络状。菇棚内的菌袋黏菌侵染后，开口处培养料和秀珍菇菌丝表现为湿腐；
子实体受害时，菌柄、菌褶和菌盖逐渐被黏菌全覆盖，导致整个子实体腐烂，散发一股酸臭味（图1a和图1b）。随之，腐烂胶体掉落到下层的菌袋上，直接引起新一轮的侵害，而掉落到地面上的黄色原生质团也会主动迁移至距离地面最近的菌袋（图1d）。因此，菇架底部的菌袋一般受害最严重。受害菌袋若不及时消毒处理，会缩水变褐，不再出菇，但光秃秃的菌袋上也不产生黏菌的繁殖体（图1c）。

图1 黏菌为害秀珍菇症状

笔者5 年的调查发现，该黏菌畏光。将受害菌棒置于阳光下暴晒，菌棒上的黏菌原生质体由黄色变为褐色，其侵害速度变缓，甚至死亡。秀珍菇出首潮菇时，一般不会出现该黏菌，2018 年第4～第5潮发病，2019—2021 年第3～4 潮菇发病，2022 年第2潮菇发病。

2.2 菌株培养特征

在燕麦琼脂培养基上，该黏菌形成黄色扇形结构的原生质团，前缘加厚，具有迁移、融合和吞噬等特征，有特殊的芳香气味，后期黄色更亮，气味更浓。原生质团在迁移过程中形态不断发生变化，可以形成管状形态和网状结构（图2）。这些特征与史立平等[14]，谷硕等[15]报道的多头绒泡菌Physarum polycephalum较吻合，因此初步判定该黏菌为绒泡菌属Physarum中的一个成员。

图2 黏菌在燕麦琼脂培养基中生长1 d（a）、4 d（b）和6 d（c）的形态特征

2.3 菌株分子鉴定

2.3.1 ITS序列PCR扩增

1%琼脂糖凝胶电泳显示，样品的PCR 产物在500～750 bp 处有一条较亮的特异性条带（图3），大小符合预期，表明ITS 序列片段被成功扩增，尽管CK（以水为模板）在500 bp 以下有一条非特异性条带。

图3 菌株的ITS序列扩增结果

2.3.2 ITS序列分析

测序结果显示ITS 扩增片段为840 bp 的rDNA序列（GenBank 登录号：OQ085095）。将该序列在NCBI GenBank 中进行Blast 检索，结果显示其与数据库中的多头绒泡菌的序列同源性最高，与序列V01159.1、M13612.1 在覆盖区域内的相似性分别为99.66%、100%，且系统发育树结果显示它与V01159.1 聚为一簇（图4）。因此，最终将该菌株鉴定为多头绒泡菌。

图4 基于ITS序列构建的系统发育树

2.4 二氧化氯防效

喷施二氧化氯溶液后黏菌在秀珍菇菌盖上的平均迁移距离为1.62 cm，而清水对照为2.66 cm，相差1 cm 左右，因此喷施二氧化氯溶液可以显著降低黏菌在菌盖的迁移距离，即减缓黏菌对菌盖的吞噬速度（图5）。基于二氧化氯是一种广谱和高效的灭菌剂，试验结果最终表明0.12%二氧化氯对该黏菌病具有一定的防效。

图5 喷施二氧化氯后黏菌的迁移距离

通过观察菇棚内黏菌为害秀珍菇症状，并对黏菌菌株进行分离与纯化培养以及黏菌ITS 序列的分析，最终确定为害盐城市秀珍菇的黏菌为多头绒泡菌。该菌常见于林中朽木及落叶，在人工培养基中生长迅速，固体培养基中能顺利完成生活史[15]，在液体培养基中可形成微原生质团[16]。该菌因其智慧的觅食方式、微原生质团细胞核分裂的一致性和无细胞壁的特征，常常被当作一种重要的试验材料，用于研究群体智能和真核细胞周期以及细胞分化与发育等。但鲜为人知的是，该菌也为害食用菌，且相关文献报道较少。

黏菌是一类特殊的真核生物，营养阶段的构造、运动和摄食方式与变形虫相似，具有动物特征，而繁殖体为子实体，此时又具有菌物的特性。若从菌物角度出发，黏菌与宿主之间的侵染关系显然不符合科赫法则，算不上一种病原物，只是表面上的腐生物，因此不受关注。然而从近些年的文献报道来看，一些黏菌在活体植物[17-19]和食药用菌上的为害还是很严重。植株表面一旦被黏菌覆盖，光合作用受阻，轻则导致生长不良，产量和品质降低，重则幼苗和植株直接枯死。而食用菌一旦感染黏菌，食用菌子实体腐烂，失去商品价值或变为一摊胶状水。随着食用菌栽培模式由原来的季节性逐渐变为周年性，个体农户生产转变为企业规模生产，早期菇棚也成为老菇棚，黏菌病害势必逐渐加重。因此，在农业生产中要重视黏菌病害的预防，尤其是食用菌。

二氧化氯消毒剂是一种高效低毒低残留的广谱消毒剂，在食用菌栽培中除常用来熏蒸消毒接种室、培养室以及出菇房外，还可以用于防治竞争性杂菌和食用菌病害。据文献报道，低至0.375 mg/L的二氧化氯可有效地抑制褐斑病病原菌托拉斯假单胞杆菌的生长（抑制率＞95%），且此体积质量浓度对平菇、金针菇、双孢蘑菇、香菇和杏鲍菇的菌丝生长不影响[20]；
采用25 mg/L、50 mg/L、50 mg/L 的二氧化氯分别处理绿色木霉、拟康氏木霉、青霉的孢子，10 min 就可将其彻底灭活[21]。研究结果表明，喷雾0.12%的二氧化氯可以减轻多头绒泡菌对秀珍菇的为害，并抑制其在菇棚内的进一步扩展。但二氧化氯防治该病的最佳用药浓度和方式、对秀珍菇生长的影响以及灭杀机理尚需进一步研究。

致谢：吉林农业大学刘淑艳教授在菌株的鉴定方面给予了详细指导。

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