血清蛋白指纹图谱预测放射性食管炎的初步研究

王 菁,杨瑞虹,李 杰

(1.山西省肿瘤医院，山西 太原 030013；
2.山西卫生健康职业学院，山西 晋中 030619)

食管癌是目前世界上最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率占我国恶性肿瘤死亡率第4位[1]。放射治疗虽然是失去手术机会食管癌患者极为重要的治疗方式，但是约有20%～30%的患者因严重的急性放射性食管炎导致放射治疗的中断。因此降低食管癌患者近期和远期疗效[2]。SELDI-TOF-MS技术是已经发展的实验室诊断技术，可用于检测如血清、胸水及各种分泌物等标本。本研究旨在对接受放射治疗食管癌患者相关血清进行检测，筛选蛋白分子标志物，发现差异蛋白，探究其对放射性食管炎的预测作用。

1.1 一般资料

本研究收集2007年6月～2011年3月山西省肿瘤医院收治的经病理明确诊断为食管鳞癌患者38例，其中男23例、女15例；
年龄42～81岁，中位年龄61.5岁；
接受常规放射治疗29例，适形调强放射治疗9例；
放射治疗剂量60～70 Gy/ 30～35次/ 2Gy；
食管病变完全缓解25例，部分缓解13例。

放射性食管炎按RTOG 急性放射损伤标准分级：
0级 无症状；
1级 轻度吞咽困难，无疼痛；
2级 轻度疼痛，不能进固体食物；
3级 吞咽疼痛严重，勉强进流食；
4级 坏死/穿孔,瘘。

1.2 试剂和仪器

CHAPS、蛋白酶抑制剂、三氟乙酸、已氰、尿素和Tris-HCl等购自美国Sigma公司；
U9缓冲液、WCX-2 buffer(结合缓冲液)、sinapinic acid(SPA)、超纯水(HPLC) 蛋白质芯片阅读机购于美国Ciphergen公司；
weak cation Exchage(WCX-2)弱阳离子交换型蛋白质芯片、Eppendorf离心机、-80℃冰箱。

1.3 方法

取晨起2 mL空腹血进行血清分离，10 μL U9缓冲液对5 μL血清进行稀释；
振荡30 min。15 mL变性后样品被加入180 μL WCX-2 buffer，总稀释倍数约39倍。将WCX-2芯片置入处理器，每孔加入200 μL WCX-2 buffer，振荡5 min，甩掉WCX-2 buffer。重复以上步骤一次。100 μL处理后样品加入芯片处理器，4℃振荡1 h。去掉样品，每孔加入200 μL WCX-2 buffer，室温振荡5 min，去掉孔中液体，加入WCX-2 buffer，重复上述步骤。快速甩出每孔加入的200 μL HPLC。将芯片处理器取出，干燥后每孔再加入SPA 1 μL。最后上机测定。

1.4 数据采集和结果分析

利用Ciphergen Protein Chip 3.0版本分析数据；
Biomarker Wizard软件分析食管癌患者血清蛋白质谱表达结果；
采用Anova检验比较差异蛋白。P<0.05为差异有统计学意义。

PBS-II C型蛋白质芯片阅读机对差异蛋白峰进行自动收集。在相对分子量2×103～20×103范围内，经Biomarker Wizard软件分析。接受放射治疗食管癌患者血清中，发现3个差异蛋白峰与放射性食管炎分级相关，且随着放射性食管炎程度加重而呈高表达。在Ⅰ和Ⅱ级，Ⅰ和Ⅲ级放射性食管炎比较中，差异具有统计学意义 (P<0.05)(表1、图1)。

表1 3个差异蛋白峰在38例不同级别放射性食管炎中的表达比较(M ± SD)

图1 6例发生不同级别放射性食管炎患者中3个差异蛋白峰的表达演变

蛋白指纹图谱技术利用激光脉冲辐射将芯池中分析物解析为荷电离子，根据不同质荷比离子在仪器场中飞行时间的长短，制定一张质谱图案[3]。国内外应用这一技术已经在肝癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌和肺癌等方面显示出较好的结果[4]。蛋白指纹图谱技术在肿瘤早期检测中的敏感性和特异性均在80%左右[3,4]。

为提高食管癌患者远期生存率，国际和国内开展大量临床研究，其中RTOG8501成为局部晚期食管癌由单一向综合治疗模式转变的里程碑实验，成为局部晚期食管癌接受同步放化疗的理论依据。同步放化疗较单一放射治疗明显提高食管癌患者远期生存率，但是并发症发生率和发生级别也相应增加。放射性食管炎即为常见的急性期副反应之一。它属于一种非感染性炎症。食管黏膜受到辐射，引起黏膜充血、水肿及糜烂，导致吞咽疼痛、进食困难甚至吞咽梗阻的发生，尤以进食硬性食物和刺激性食物时明显。联合化疗，食管炎症状会显著加重。可导致患者恐惧进食，甚至饮水。随着症状进一步加重，可出现胸部剧痛、发热和呛咳等症状，最终有食管穿孔或食管气管瘘发生的风险。针对目前食管癌非手术治疗现状，怎样做到对放射性食管炎的早发现和早防治，是临床医生急需解决的问题之一。探寻有效预测放射性食管炎的标志物就显得尤为重要。本研究利用蛋白芯片技术对接受放疗的食管癌患者血清进行检测，发现相对分子量为2 639、2 816和5 744的3个差异蛋白峰在Ⅰ级放射性食管炎发展为Ⅱ级或Ⅲ级时，峰值明显升高，具有统计学差异。提示上述3个差异蛋白峰如果呈逐渐高表达，预示放射性食管炎程度有加重趋势。在临床工作中，监测Ⅰ级放射性食管炎患者血清中2 639、2 816和5 744 3个差异蛋白峰的变化，如果呈高表达，即需要格外警惕这类型患者是否属于放射线敏感群体，是发展成高级别放射性食管炎的高危患者。针对这类型患者群体，临床医生在制定放疗和化疗方案，遵照相关临床指南的同时，即需要遵循个体化原则，开展个体化治疗，以保证食管癌患者抗肿瘤治疗顺利进行，有效防止放射性食管炎向高级别发展，提高患者生存质量，保证其近期和远期疗效。在防治和干预过程中，可动态观测相关3个差异蛋白峰，其表达如果呈逐渐降低趋势，则表明干预有效。反之，临床医师需要注意，这类型患者是否适合接受强度高于放疗的同步放化疗，是否适合接受高剂量放疗剂量等。

本研究结果初步显示血清蛋白指纹图谱在放射性食管炎预测中的作用。由于研究样本量偏少，需要继续扩大样本量，对其进一步深入研究，以期发现对放射性食管炎预测的有效标志物，对其防治起到指导作用，保证食管癌患者抗肿瘤治疗的顺利进行。

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