甘露消毒丹及其拆方对肺炎支原体干预的NR8383,细胞炎症因子表达的影响

郑 豪 张葆青 周 旭

1.山东中医药大学第一临床医学院，山东济南 250355；
2.山东中医药大学附属医院中医儿科，山东济南 250014

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）感染是引起儿童社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）的重要原因，该病近年呈现上升趋势，严重威胁患儿的身心健康[1-3]。目前西医治疗该病多采用抗生素、免疫抑制剂和对症治疗等措施，但均有一定的缺陷和副作用[4]，因此继续寻找安全有效的MP肺炎（Mycoplasmal pneumoniae pneumonia，MPP）治疗药物尤为必要。甘露消毒丹由叶天士所创，后由王孟英收入《温热经纬》，专为湿温时疫而设，具有较强的抗菌和抗病毒作用[5]。网络药理研究发现，方中槲皮素、木犀草素等多种化学成分能有效作用于肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-10 等MPP 核心靶点[6]。张葆青教授化裁本方治疗儿童MPP 湿热闭肺证，并根据多年经验舍弃肾毒性较强的木通，用清热化痰力强的浙贝母代替川贝母，临床效果颇验，但关于本方治疗MPP 的实验依据相对欠缺，故本研究探讨甘露消毒丹含药血清对MP 感染的大鼠肺泡巨噬细胞（NR8383）炎症因子表达的调控作用，并将其分解为拆方1（味辛性热的阳性药物）和拆方2（味苦性寒的阴性药物），观察两类药物对炎症因子的调控有无差异，以期从中医阴阳的角度为MPP 的临床治疗提供依据。

1.1 实验动物

选取8 周龄SPF 级雌性Wistar 大鼠，体重（200±10）g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证编号：SCXK（京）2016-0006；
合格证号：11001121-1104764715]，饲养于山东中医药大学（以下简称“我校”）动物中心，期间给予常规饮食、自然光线、避免噪声干扰、定时更换垫料等措施，适应性喂养1 周，观察大鼠饮食、二便、行为等无明显异常即可进行，实验动物伦理由山东中医药大学动物福利伦理审查委员会受理（2021-60）。

1.2 细胞株及菌株

NR8383 细胞株购买于中国医学科学院基础医学研究所；
MP 菌株（ATCC-15531）购买于上海宝录生物科技有限公司。

1.3 实验药物

中药由山东中医药大学附属医院门诊中草药房提供。甘露消毒丹组成：藿香12 g、茵陈15 g、黄芩9 g、连翘9 g、石菖蒲12 g、豆蔻9 g、浙贝9 g、薄荷6 g、射干9 g、滑石15 g。拆方1 组成：藿香12 g、石菖蒲12 g、豆蔻9 g、薄荷6 g。拆方2 组成：茵陈15 g、黄芩9 g、连翘9 g、浙贝9 g、射干9 g、滑石15 g。阿奇霉素胶囊（北京四环制药有限公司，21051751，0.25 g×6 粒）。

1.4 主要仪器与试剂

生物安全柜（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司，BHC-1300ⅡA2）、离心机（长沙平凡仪器仪表有限公司，TDZ5-WS）、低温高速离心机[美瑞克仪器（上海）有限公司，MH-1650R]、二氧化碳细胞培养箱（Thermo，HERAcell150i）、恒温恒湿培养箱（上海跃进医疗器械有限公司，LRHS-150-Ⅲ）、低温冰箱（合肥美菱股份有限公司，BCD-200MCX）、荧光倒置显微镜（OLYMPUS，CKX41）、酶标仪（北京普朗新技术有限公司，DNM-9602）、实时荧光定量PCR 仪（Roche，Light Cycle）、显影仪（GE 医疗，Amersham Imager 600）。

F-12K 培养基和进口胎牛血清（中国医学科学院基础医学研究所），支原体肉汤培养基（青岛海博生物技术有限公司，HB7025-2），注射用青霉素钠（山东鲁抗医药股份有限公司，43210512），增强型细胞活力检测试剂盒（CCK-8，Elabsciense，E-CK-A362），大鼠TNF-α、IL-1β、IL-10 酶联免疫吸附试验试剂盒（El-absciense，E-EL-R2856c、E-EL-R0012c、E-EL-R 0016c），SPARKeasyImprovedTissue/CellRNAKit（Spark-Jade，AC0202），SPARKscriptⅡRT Plus Kit（SparkJade，AG0304），2× SYBR Green qPCR Mix（Spark Jade，AH0104），PAGE 凝胶快速制备试剂盒（Epizyme，PG112），β-Actin Rabbit mAb（Cell Signaling Technology，4970），Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）Polyclonal Antibody（Thermo Fisher，48-2300），MyD88 Rabbit mAb（Cell Signaling Technology，4283），核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）-p50 Rabbit mAb（Cell Signaling Technology，13586），Anti-rabbit IgG HRPlinked Antibody（Cell Signaling Technology，7074）。

1.5 研究方法

1.5.1 药物制备 各组中药分批熬制，加水没过药材（滑石先下包煎，藿香、豆蔻、薄荷后下），大火煮沸后转小火煮30 min，滤出药液，重复3 次，药液合并后低温冷凝回流浓缩至2 g/ml 的生药浓缩液，分装后于-20℃冷冻保存。阿奇霉素胶囊用生理盐水配制成5 mg/ml 的混悬液。

1.5.2 含药血清制备 将35 只大鼠按随机数字表法分为空白血清组、甘露消毒丹血清组、阿奇霉素血清组及拆方1、2 血清组，每组7 只。根据计算公式换算大鼠的给药标准，以6 岁儿童（体重20 kg）的用量为标准，大鼠剂量=（药物总量/儿童体重）×比例系数6.3[7]，阿奇霉素血清组，拆方1、2 血清组，甘露消毒丹血清组的给药剂量分别为0.063、12.3、20.8、33 g/（kg·d），空白血清组予2ml/d 的生理盐水，五组均灌胃给药，1次/d，连续给药1 周，末次给药2 h 后采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3 ml/kg），腹主动脉取血，离心（转速为3 000 r/min，离心半径为170 mm，离心时间为15 min）分离血清，水浴灭活（56℃下30～40 min），无菌条件下用0.22 μm 过滤器过滤，分装至2 ml 冻存管并做好标记，-80℃冻存备用。

1.5.3 NR8383 细胞培养 细胞培养于含15%灭活胎牛血清的F-12K 培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，每隔2～3 d 换液1 次，待细胞在T25 瓶中汇合至80%时按1∶2 的比例传代。

1.5.4 细胞活力检测96 孔板采用5×105个/ml 细胞铺板，100 μl/孔，加入100 μl 培养基，孵育过夜后分别加入5 种血清5 μl，无血清处理的细胞加入5 μl 培养基，孵育24 h。孵育结束后，所有孔加10 μl CCK-8 溶液，2 h 后采用酶标仪测量450 nm 处的吸光度，每孔测量3 次取平均值，每种处理设置3 个复孔，计算细胞存活率[7]。

1.5.5 MP 培养MP 培养于含20%胎牛血清和800 U/ml青霉素的支原体肉汤培养基中，置于37℃培养箱中恒温培养，待菌液由红色变为黄色时按1∶10 的比例传代。

1.5.6 MP 浓度测定96 孔板设10 个组，每组3 复孔平行操作，向所有孔中加入180 μl MP 肉汤培养基，取20 μl 待传代的菌液加入第1 孔，混匀后从第1 孔吸取20 μl 菌液加入第2 孔，以此类推，依次按1∶10 的比例递减稀释，并设阴性和阳性对照，所有孔加3滴石蜡油防止蒸发，盖好板盖，做好标记，37℃恒温孵育，每日观察，直至颜色不再发生改变，取106～107CCU/ml菌液备用[8]。

1.5.7 细胞分组及给药 将NR8383 细胞设置对照组、模型组、甘露消毒丹组、阿奇霉素组及拆方1、2 组。调整细胞浓度为1.2×106个/ml，取6 个T25 瓶，每瓶加入5 ml 孵育过夜。取30 ml 浓度为106～107CCU/ml的MP 菌液离心（温度为20℃，离心条件为12 000 g，离心时间为20 min），用5 ml 细胞培养液重悬，平均加入模型组、甘露消毒丹组、阿奇霉素组及拆方1、拆方2 组中，每组1 ml，对照组加1 ml 不含MP 的细胞培养液，孵育4 h。然后分别向甘露消毒丹组、阿奇霉素组及拆方1、2 组加300 μl 对应含药血清，对照组和模型组加300 μl 空白血清，孵育24 h 后收集细胞及上清液，按试剂盒要求保存备测。

1.5.8 qRT-PCR 根据试剂盒要求提取细胞RNA 后，将其逆转为cDNA，反应体系为2×SYBR qPCR Mix 5.0 μl，cDNA 1.0 μl，正、反向引物各0.2 μl，RNase Free H2O 3.6 μl。用2-ΔΔCt法计算基因相对表达水平。引物序列见表1，ACTB 为内参基因。

表1 引物序列

1.5.9 蛋白质印迹法 提取各组细胞蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度，SDS-PAGE 法分离蛋白后转移至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭过夜，兔β-actin、TLR4、MyD88、NF-κB-p50 抗体（稀释倍数为1∶1 000、1∶50、1∶1 000、1∶1 000）室温孵育2 h，HRP 标记的山羊抗兔IgG（稀释倍数为1∶2 000）室温孵育1 h，显色成像获得蛋白条带，Image J 软件计算灰度值。

1.5.10 酶联免疫吸附试验检测各组细胞上清液炎症因子的表达 分别检测各组细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-10 的表达，操作按试剂盒说明书进行。采用Origin 9.64 进行促炎性细胞因子的浓度换算。

1.6 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（）表示，两组比较采用t 检验；
多组计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 含药血清对NR8383 细胞活力的影响

各血清处理的细胞存活率均低于无处理的细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）。各血清处理细胞存活率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 不同血清处理细胞与未处理细胞存活率比较（n=3）

2.2 六组TLR4、MyD88、NF-κB-p50 mRNA 表达比较

模型组TLR4、MyD88、NF-κB-p50 mRNA 表达高于对照组，甘露消毒丹组、拆方2 组TLR4、MyD88、NFκB-p50 mRNA 表达低于模型组，拆方1 组MyD88 mRNA 表达低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。甘露消毒丹组TLR4、MyD88mRNA 表达低于拆方1组，NF-κB-p50 mRNA 表达高于拆方2 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 六组TLR4、MyD88、NF-κB-p50 mRNA 表达比较（n=3）

2.3 六组TLR4、MyD88、NF-κB-p50 蛋白水平比较

模型组TLR4、MyD88、NF-κB-p50 蛋白水平高于对照组（P＜0.05）。甘露消毒丹组、拆方2 组TLR4、MyD88、NF-κB-p50 蛋白水平低于模型组，拆方1 组TLR4 蛋白水平低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。甘露消毒丹组TLR4、MyD88、NF-κB-p50蛋白水平低于拆方1 组，TLR4 蛋白水平高于拆方2组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3～4。

图3 六组TLR4、MyD88、NF-κB-p50 蛋白表达条带图

图4 六组TLR4、MyD88、NF-κB-p50 蛋白水平比较（n=3）

2.4 五组细胞上清液炎症因子水平比较

甘露消毒丹组、拆方2 组TNF-α、IL-1β 水平低于模型组，拆方1 组IL-1β 水平低于模型组，拆方2组IL-10 低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。甘露消毒丹组TNF-α、IL-1β、IL-10 水平均低于拆方1 组，TNF-α、IL-1β 水平高于拆方2 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

图5 五组细胞上清液炎症因子水平比较（n=3）

儿童MPP 属于中医“肺炎喘嗽”“马脾风”“风温时疫”等范畴，多因小儿卫外不固、复感外邪所致[9-10]。MP感染与湿热因素关系密切[11]，夏秋为MP 感染流行的季节，正值湿热邪气当令[12]，小儿为纯阳之体，外邪侵袭，易入里化热，内外合邪，发为本病[13]，故以清利湿热为治疗大法。甘露消毒丹主治湿热并重之湿温时疫，恰合儿童MPP 湿热证的病因病机，方中茵陈、黄芩、滑石清利湿热；
豆蔻、石菖蒲、藿香化湿和中；
连翘、薄荷、射干清热解毒，浙贝母化痰止咳、清热散结，相较于川贝母少甘润而多苦寒，更适合湿热郁结之咳嗽，诸药合用共奏利湿化浊、清热解毒之功。

免疫炎症是MPP 的自我保护机制之一，但过度炎症也是导致病情恶化的重要原因[14]。TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路与炎症有关，其激活后过度产生的TNF-α、IL-1β 等促炎性细胞因子通过与靶细胞的特异性受体结合而加重炎症反应，是造成患儿肺部损伤的重要原因[15-18]。研究发现，由MP 感染引起的肺炎患儿血清中TNF-α 的表达明显上升[19-21]；
MP 产生的CARDS TX 可催化腺苷二磷酸核糖基化激活NLRP3炎症小体，诱导IL-1β 的产生[22]，其表达与病情严重程度密切相关[23]。IL-10 是一种负性调节因子[24]，其可抑制过度炎症损害宿主本身[25]，研究显示，在MPP 患儿急性期IL-10 的表达相对较低，经治疗后其表达上升[26]，说明其参与了疾病恢复期的炎症消退和组织修复。但也有研究指出，重症MPP[27]和难治性MPP[28]患儿血清中IL-10 的表达与病情的严重程度呈正相关，这可能与其调控免疫的功能相关，在免疫紊乱时其表达随着炎症程度的加重而上升，从而限制过度炎症带来的组织损害，因此IL-10 可能是儿童MPP 严重程度的重要预测指标。

甘露消毒丹由阳性药物和阴性药物组成，但两种药物对炎症因子的表达调控可能存在差异，其作用方向也可能不同。本研究结果显示，甘露消毒丹及其拆方含药血清均能不同程度地下调MP 感染的NR8383细胞中TNF-α、IL-1β 水平，其机制可能与调控TLR4/MyD88/NF-κB 通路相关。中药三组综合来看拆方2组效果最优，甘露消毒丹组次之，拆方1 组下调作用较低，提示阴性药物对促炎性细胞因子的下调作用较明显，阳性药物效果欠佳。从中医角度分析其原因可能是炎症多以红、肿、热、痛为主要表现，其为阳证，阴性药物与之相克，故其效佳。正如《景景室医稿杂存·以药治病关乎气化说》记载：“病也者，不过寒热有所偏颇……以寒气之药化病气之热，以热气之药化病气之寒……是药之所以能治病者。”也体现出中医“治热以寒”的诊疗思维。IL-10 具有较强的免疫调节功能，在本研究中其表达上调可能是为了平衡促炎环境，避免大量促炎性细胞因子损害细胞本身，其表达水平与炎症程度呈正相关，因此推断拆方2 组IL-10 表达较低的原因可能是该组含药血清较大程度地抑制了TNF-α、IL-1β 等促炎性细胞因子的表达，从而间接降低了IL-10 的水平。

总之，本研究初步验证了甘露消毒丹及其拆方含药血清对MP 感染的NR8383 细胞炎症因子表达的影响，但MP 感染后细胞因子的表达调控是一个极其复杂的过程，其表达在体外细胞和体内有很大差异，因此后期仍需在本研究的基础上进一步阐明甘露消毒丹的作用机制。此外，虽然拆方1 组和拆方2 组含药血清均能下调促炎性细胞因子的表达，但仅用辛热药或苦寒药治疗疾病不符合中医“谨察阴阳而调之，以平为期”的观点，容易打破机体“阴平阳秘”的状态，故其缓解炎症的机制究竟是调节免疫反应还是破坏免疫平衡有待进一步研究。

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