首发精神分裂症患者血清miR-146a-5p、TRAF6的表达及意义*

徐婷婷，傅正闯，张鹏，徐芳芳，沈琦琦，戴泗超

(杭州师范大学附属萧山医院精神科，杭州 311200)

精神分裂症(schizophrenia，SZ)是一种常见的精神障碍疾病，认知缺陷是其核心特征，但其发生机制至今仍未阐明[1-2]。SZ多发生于青春期，影响全世界约1%的人口，由于其病情反复发作且治愈率低，漫长的病程会对家庭造成沉重的负担，因此，早期诊断极其重要[1，3-4]。研究表明，超过50%的miRNA微小RNA(miRNA)在中枢神经系统的神经发育、突触功能调节过程中具有重要作用，表明其可能参与精神疾病的发展[1-5]。另有研究发现，微小RNA-146a(miR-146a)在中枢神经系统疾病抑郁症患者外周血单核细胞中的表达水平异常降低，并参与了抑郁症的发生，但其是否参与SZ的发生目前尚不明确[6]。肿瘤坏死因子受体相关因子6(TNF receptor-associated factor-6，TRAF6)是miR-146a-5p的靶基因，其在抑郁症大鼠海马组织中的表达水平异常增加[5]；
而miR-146a-5p可通过抑制TRAF6的表达以防止免疫过度[7]。本研究旨在通过探究首发SZ患者血清miR-146a-5p、TRAF6mRNA表达水平的变化并分析其临床意义，以期为疾病的早期诊断及临床治疗提供实验依据。

1.1一般资料 选取2019年2月至2021年4月于杭州师范大学附属萧山医院精神科就诊的95例首发SZ患者作为SZ组，女性45例，男性50例，年龄(42.63±10.07)岁；
选择同期体检健康者98例作为健康人对照组，女性47例，男性51例，年龄(41.39±8.98)岁。纳入标准：符合SZ诊断标准[8]；
首次发作；
未服用其他精神病相关药物。排除标准：神经系统或免疫系统疾病患者；
妊娠、哺乳期患者；
无家族病史。本研究经杭州师范大学附属萧山医院医学伦理委员会批准(批准文号：1901-002)，各研究对象均知情同意。

1.2主要试剂与仪器 反转录试剂盒(上海科敏生物科技公司)，荧光定量PCR试剂盒(上海吉玛制药技术公司)。FQD-16A型荧光定量PCR仪(杭州诺丁科学器材公司)，超微量分光光度计(广州飞迪生物科技公司)。

1.3方法

1.3.1标本采集 SZ患者住院次日和使用利培酮治疗4周后(健康体检人员在体检当日早晨)空腹抽取静脉血4 mL，静置10 min，离心(3 000 r/min、r=16 cm)取上清，置于-80 ℃保存以待检测。

1.3.2RNA提取及qRT-PCR检测 采用TRIzol试剂提取血清中的总RNA，采用超微量分光光度计检测其浓度及纯度，以浓度为100～500 ng/μL，吸光度(A260 nm/A280 nm)值为1.8～2.0的样本为合格样本并进行反转录，将所得cDNA样本置于-80 ℃保存，以cDNA作为模板进行qRT-PCR扩增。miR-146a-5p和TRAF6内参分别为U6和β-actin，miR-146a-5p、TRAF6mRNA的GenBank序列号分别为NC_000005.10、NC_000011.10；
内参U6和β-actin基因的序列号分别为NC_000015.10、BC002409，用Primer Premier 5.0软件设计引物，并送深圳华大基因科技公司合成。引物序列见表1[9]。PCR总反应体系为20 μL，包括2 μL 10 mmol/L 10×miScript Universal Primer，10 μL PCR Mix，4 μL无RNA酶水，10 μmol/L上、下引物2 μL，2 μL cDNA。PCR循环参数：90 ℃ 15 min；
94 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共40个循环。在70 ℃时使用LightCycler®96软件收集荧光信号并进行熔解曲线分析。采用2-ΔΔCt法分析miR-146a-5p和TRAF6mRNA的表达水平，各重复孔间Ct值相差应<0.5，取其均值。公式：ΔΔCt=(Ct实验组目的基因-Ct内参基因)-(Ct健康人对照组目的基因-Ct内参基因)]。

表1 miR-146a-5p、TRAF6引物序列

2.1受试者一般资料比较 与健康人对照组相比，SZ组患者年龄、BMI、性别、吸烟史、饮酒史之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 一般资料比较

2.2两组受试者血清miR-146a-5p与TRAF6mRNA水平比较 与健康人对照组相比，SZ组患者血清miR-146a-5p的表达水平(1.00±0.13 vs 0.79±0.18)显著降低(t=9.963，P<0.01)，TRAF6mRNA的表达水平(1.01±0.12 vs 1.38±0.4)显著增加(t=9.403，P<0.01)，且二者呈显著负相关(r=-0.444，P=0.000)；
与治疗前相比，治疗后SZ组患者血清miR-146a-5p的表达水平(1.01±0.10 vs 1.36±0.29)显著增加(t=11.121，P<0.01)，TRAF6mRNA的表达水平(1.00±0.12 vs 0.76±0.19)显著降低(t=10.409，P<0.01)，且二者呈显著负相关(r=-0.428，P=0.000)。

2.3SZ组患者血清miR-146a-5p和TRAF6mRNA水平与PANSS评分的相关性 SZ组患者PANSS阳性：(18.69±4.39)分，PANSS阴性：(22.38±5.85)分；
一般精神病理症状：(36.95±10.88)分；
PANSS总评分：(78.76±13.21)分。miR-146a-5p水平与PANSS总评分、PANSS阳性及一般精神病理症状均呈显著负相关(P<0.05)，而与PANSS阴性无相关性(P>0.05)；
TRAF6mRNA水平与PANSS总评分、PANSS阳性及一般精神病理症状均呈显著正相关(P<0.01)，而与PANSS阴性无相关性(P>0.05)。见表3。

表3 SZ组患者血清miR-146a-5p和TRAF6 mRNA水平与PANSS评分的相关性

2.4SZ组患者血清miR-146a-5p和TRAF6mRNA水平与WCST评分的相关性 SZ组患者WCST完成分类数：(4.09±1.22)分，非持续性错误数：(18.15±5.04)分，持续性错误数：(46.25±11.82)分，错误应答数：(67.20±13.82)分；
miR-146a-5p水平与非持续性错误数、错误应答数均呈显著负相关(P<0.05)，但与完成分类数、持续性错误数无关(P>0.05)；
TRAF6mRNA水平与非持续性错误数、错误应答数均呈显著正相关(P<0.05)，而与完成分类数、持续性错误数无关(P>0.05)。见表4。

表4 SZ组患者血清miR-146a-5p和TRAF6 mRNA水平与WCST评分的相关性

2.5ROC曲线评估miR-146a-5p与TRAF6在首发SZ中的诊断价值 健康人对照组miR-146a-5p与TRAF6水平定义为0(未发生)，SZ组定义为1(发生)。ROC曲线评估miR-146a-5p诊断首发SZ发生的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.860(95%CI：0.803～0.916)，当cut-off值为0.825时，敏感性66.30%，特异性95.90%；
评估TRAF6诊断首发SZ发生的AUCROC为0.805(95%CI：0.736～0.873)，当cut-off值为1.187时，敏感性63.20%，特异性93.90%；
二者联合诊断首发SZ发生的AUCROC为0.898(95%CI：0.849～0.948)，敏感性84.20%，特异性68.40%。相较于miR-146a-5p、TRAF6单独诊断，二者联合检测诊断首发SZ发生的AUCROC显著增加(Z=2.037，P=0.042；
Z=2.162，P=0.031)。见图1。

图1 ROC曲线评估miR-146a-5p与TRAF6在首发SZ中的诊断价值

2.6Logistic回归分析影响首发SZ发生的因素 以首发SZ发生与否为因变量(否=0，是=1)，miR-146a-5p水平(均值：<0.897=0，≥0.897=1)、TRAF6水平(均值：<1.192=0，≥1.192=1)、年龄(均值：<42.000=0，≥42.000=1)、BMI(均值：<22.888=0，≥22.888=1)、饮酒史(有=1，无=0)、吸烟史(有=1，无=0)为自变量，Logistic回归分析结果表明，miR-146a-5p低表达及TRAF6高表达是影响首发SZ发生的危险因素(P<0.05)，而年龄、BMI、饮酒史、吸烟史与首发SZ发生无关(P>0.05)。见表5。

表5 Logistic回归分析

SZ多发生于青壮年人群，早期患者智力正常、意识清晰，但由于目前SZ的诊断依赖于观察和临床访谈，存在可变性及主观性，所以容易导致误诊或诊断延误的情况发生，患者若不能得到及时治疗，延误病情，将会导致精神残疾及智力衰退，因此，SZ早期诊断对于改善疗效至关重要[10]。

现今，人们对寻找SZ诊断生物学标志物的兴趣逐渐增加，越来越多的研究证实miRNA参与了SZ的发生，如miR-146a参与抑郁症等精神疾病的发生。有学者发现，其水平下降与SZ的发生有关[11]。本研究发现，SZ组患者血清miR-146a-5p表达异常降低，与其他研究结果相一致[11]，表明miR-146a-5p参与了首发SZ的发生，可能作为SZ治疗进展的评估指标。本研究还发现，miR-146a-5p水平与PANSS及WCST评分指标存在负相关性，表明miR-146a-5p与首发SZ患者症状严重程度及认知障碍密切相关，与其他研究结果相似[12]，证实其可能作为首发SZ的临床检测指标。

免疫炎症机制在SZ进程中占有重要地位，与患者的认知功能障碍相关[13]。TRAF6作为炎症因子，介导了NF-κB通路激活，进而促使炎症反应的发生[14]。miR-146a/TRAF6轴已被认为是重要的防止免疫过度反应的分子制动器[6]。本研究发现，SZ组患者血清TRAF6表达异常增加，而治疗后其表达水平显著降低，并且与PANSS及WCST评分指标存在一定的正相关关系，表明TRAF6可能参与了首发SZ的发生，且与患者疾病严重程度及认知障碍相关，可用于监测临床治疗进程。除此之外，本研究还发现，在治疗前后，TRAF6与miR-146a-5p水平呈显著负相关，表明miR-146a-5p低表达可能通过促进TRAF6的表达，致使患者发生过度炎症反应及认知障碍，从而参与首发SZ的发生。

本研究还发现，miR-146a-5p、TRAF6联合诊断首发SZ发生的ROC曲线下面积显著高于二者单独诊断，并证实miR-146a-5p低表达及TRAF6高表达是影响首发SZ发生的危险因素。表明miR-146a-5p与TRAF6联合检测对首发SZ的发生具有较高的诊断价值，二者具有作为首发SZ早期诊断生物学标志物的潜能。

综上所述，首发SZ患者血清miR-146a-5p和TRAF6的表达与疾病严重程度密切相关，二者有望成为首发SZ早期诊断及临床检测指标。本研究不仅为首发SZ的早期诊断指标的寻找提供参考依据，还对SZ发生机制的研究具有重要意义，但由于样本量的限制，本研究结果可能存在偏差，因此，今后笔者会继续加大样本量，并且进行基础研究，以阐明二者在首发SZ中的具体作用机制。

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